一种活细胞内质网自噬成像分析化合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种活细胞内质网自噬成像分析化合物及其制备方法，其为荧光探针ER

【技术实现步骤摘要】
一种活细胞内质网自噬成像分析化合物及其制备方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种活细胞内质网自噬成像分析化合物及其制备方法。

技术介绍

[0002]内质网(ER)是一种膜封闭的管状细胞器，介导蛋白质的加工、折叠和运输，以及代谢、离子储存等细胞活动。内质网稳态的破坏，与多种人类疾病相关
[2
‑
7]。因此发展内质网自噬的分析方法，对于探索内质网自噬相关的病理、生理作用
[8]和开发内质网自噬诱导药物
[5]具有重要意义。
[0003]迄今为止，内质网自噬主要通过检测ER蛋白的水平或者带有ER信号肽的荧光蛋白(如ssGFP
‑
RFP
‑
KDEL)。前者灵敏度较低，因为内质网自噬过程中消耗的蛋白数量远远小于内质网总体蛋白的数量，变化细微难以检测；而后者周期长，不适用于原代细胞。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于克服现有技术缺陷，提供一种活细胞内质网自噬成像分析化合物。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供上述活细胞内质网自噬成像分析化合物的制备方法。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种活细胞内质网自噬成像分析化合物，其为荧光探针ER
‑
proRed，其结构式为
[0008][0009]上述活细胞内质网自噬成像分析化合物的制备方法，其合成路线如下：
[0010][0011]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述S1的合成包括：将ROX
‑
EDA、丙炔酸和4
‑
(4，6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉盐酸盐加入DMF中，室温搅拌反应5
‑
7h，然后依次经油泵抽干、复溶于DCM、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相、有机相脱水并减压浓缩和Al2O3柱层析纯化，即得所述S1。
[0012]进一步优选的，所述ROX
‑
EDA、丙炔酸和4
‑
(4，6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉盐酸盐和DMF的比例为0.75mmol∶1.00mmol∶1.5mmol∶7.5mL。
[0013]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述S3的合成包括：将所述S2、2
‑
叠氮基乙氨、Pd(OAc)2、4，5
‑
双二苯基膦
‑
9，9
‑
二甲基氧杂蒽和Cs2CO3加入无水甲苯中，于110
‑
125℃加热回流0.8
‑
1.2h，然后依次经减压浓缩、DCM复溶、水洗涤、萃取分离、有机相脱水并减压浓缩和硅胶柱层析分离纯化，即得所述S3。
[0014]进一步优选的，所述S2、2
‑
叠氮基乙氨、Pd(OAc)2和4，5
‑
双二苯基膦
‑
9，9
‑
二甲基氧杂蒽、Cs2CO3和无水甲苯的比例为0.31mmol∶0.48mmol∶0.31mmol∶0.047mmol∶0.94mmol∶10mL。
[0015]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述ER
‑
proRed的合成包括：将所述S1和所述S3溶解于四氢呋喃中，在氮气保护气氛下，加入预混的CuSO4·
5H2O和抗坏血酸钠的混合水溶液，室温条件下反应8
‑
15h，然后依次经减压浓缩、DCM复溶、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相、有机相脱水并减压浓缩和Al2O3柱层析纯化，即得所述ER
‑
proRed。
[0016]进一步优选的，所述S1、所述S3和四氢呋喃的比例为0.13mmol∶0.20mmol∶2mL。
[0017]荧光探针ER
‑
proRed作为活细胞内质网自噬成像分析剂的应用，该荧光探针ER
‑
proRed的结构式为
[0018]荧光探针ER
‑
proRed在筛选内质网自噬诱导剂中的应用，荧光探针ER
‑
proRed的结构式为
[0019]本专利技术的有益效果是：
[0020]1、如图1所示，在FHR的作用下，本专利技术在内质网内富集，发出绿色荧光；当发生内质网自噬时，本专利技术伴随着内质网进入酸性溶酶体，开启酸响应的强烈红色荧光信号，从而实现对内质网自噬过程的分析。
[0021]2、本专利技术合成工艺简单，易于推广。
[0022]3、本专利技术灵敏度高，适用性广，使用方便，可被用于细胞内质网自噬成像分析和筛选内质网自噬诱导剂等。
附图说明
[0023]图1为本专利技术的作用原理图。
[0024]图2为本专利技术实施例1中化合物ER
‑
proRed的1H NMR(CDCl3)。
[0025]图3为本专利技术实施例1中化合物ER
‑
proRed的
13
C NMR(CDCl3)。
[0026]图4为本专利技术实施例1中为化合物ER
‑
proRed的高分辨质谱图。
[0027]图5为本专利技术实施例3中荧光探针ER
‑
proRed对pH响应的发射光谱图。
[0028]图6为本专利技术实施例4中荧光探针ER
‑
proRed在细胞中的内质网定位图。
[0029]图7为本专利技术实施例5中荧光探针ER
‑
proRed用于饥饿诱导条件下的细胞内质网自噬成像分析结果图。
[0030]图8为本专利技术实施例6中荧光探针ER
‑
proRed用于内质网自噬受体过表达条件下的细胞内质网自噬成像分析结果图。
具体实施方式
[0031]以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0032]实施例1：制备荧光探针ER
‑
proRed
[0033]本实施例制得的ER
‑
proRed的结构式如下：
[0034][0035]ER
‑
proRed正常内质网中显示为绿色荧光信号，当发生内质网自噬时，探针ER
‑
proRed伴随内质网进入溶酶体，在酸的响应下，发射出明亮的红色荧光信号。其合成路线如下：
[0036][0037]具体包括如下步骤：
[0038](1)ROX
‑
EDA是根据Responsive hetero
‑
organelle partition conferred fluorogenic sensing of mitochondrial depolarization.Chem Sci 2017；8：1915
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种活细胞内质网自噬成像分析化合物，其特征在于：其为荧光探针ER
‑
proRed，其结构式为2.权利要求1所述的活细胞内质网自噬成像分析化合物的制备方法，其特征在于：其合成路线如下：3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述S1的合成包括：将ROX
‑
EDA、丙炔酸和4
‑
(4，6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉盐酸盐加入DMF中，室温搅拌反应5
‑
7h，然后依次经油泵抽干、复溶于DCM、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相、有机相脱水并减压浓缩和Al2O3柱层析纯化，即得所述S1。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述ROX
‑
EDA、丙炔酸和4
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(4，6
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二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉盐酸盐和DMF的比例为0.75mmol∶1.00mmol∶1.5mmol∶7.5mL。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述S3的合成包括：将所述S2、2
‑
叠氮基乙氨、Pd(OAc)2、4，5
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双二苯基膦
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9，9
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二甲基氧杂蒽和Cs2CO3加入无水甲苯中，于110
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125
℃加热回流0.8
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：韩守法，施一龙，邹小雪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：