一种用于检测丁香酚残留量的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种化合物，基于此化合物，建立了丁香酚的荧光偏振免疫检测法用于检测水产品中的丁香酚残留量，该荧光偏振免疫检测法对丁香酚的检测范围为6.2～495.7ng/mL，检测限为1.7ng/mL，灵敏度可达55.4ng/mL。并基于该化合物和荧光偏振免疫检测法建立了用于检测丁香酚残留量的试剂盒。该方法操作简单，检测数量大，灵敏度高，可用于水产品中麻醉剂丁香酚残留的快速筛查测定。香酚残留的快速筛查测定。香酚残留的快速筛查测定。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测丁香酚残留量的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及麻醉剂检测领域和免疫分析
，具体地，涉及一种用于检测丁香酚残留量的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]丁香酚(Eugenol)，化学名4
‑
烯丙基
‑2‑
甲氧基苯酚，由于其对鲜活水产品具有良好的抗菌和麻醉效果，能有效降低鱼体在运输过程中的损伤率和死亡率，并且价格低廉，因而在水产行业中常被作为渔用的麻醉剂。然而，丁香酚的使用安全性尚存在争议，我国农业行政主管部门尚未将其纳入“水产养殖用药明白纸中”。有研究表明丁香酚的残留可能造成哺乳动物肝脏损伤，甚至具有潜在的致癌作用，其在食品中的残留以及水产品收储运环节的使用状况值得关注。
[0003]丁香酚的检测目前主要采用仪器检测的方法，其中气相色谱
‑
质谱联用法 (GC
‑
MS)和液相色谱
‑
质谱联用法(LC
‑
MS)应用最为广泛。但仪器检测法需要昂贵的分析设备，且方法操作复杂，需受过专门训练的人员才能操作，其普遍应用受到很大限制，因此有必要建立一种简单、快速、高灵敏度的检测方法用于检测水产品中的丁香酚。现有技术(CNKI:SUN:SPAJ.0.2019
‑
20
‑
036)中记载的丁香酚检测方法的检出限为2.0mg/ml，检测限不够低，不能精准检测出物质中残留的丁香酚。
[0004]而免疫分析检测具有灵敏度高、特异性好、快速简便的优点，非常适用于现场快速筛查与检测。其中，荧光偏振免疫分析法较为特殊，其不需要固相免疫分析过程中多次洗涤的步骤，反应系统完全处于溶液中，只需将待测样品、荧光示踪物和特异性的抗体混合，一步反应从而几分钟内就可以迅速实现定量检测的目的。设计结构合理的荧光示踪物是建立丁香酚荧光偏振免疫分析法的核心步骤。目前，国内外尚未见丁香酚荧光示踪物及其相关荧光偏振免疫分析方法的研究报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种一种用于检测丁香酚残留量的试剂盒及其应用。
[0006]本专利技术的第一目的是提供一种结构式如式I所示的化合物。
[0007]本专利技术的第二目的是提供上述化合物的制备方法。
[0008]本专利技术的第三目的是提供一种丁香酚荧光偏振免疫检测法。
[0009]本专利技术的第四目的是提供一种检测丁香酚残留量的试剂盒。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0011]一种化合物，所述化合物的结构式如式(I)所示，
[0012][0013]结构式如式I所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0014]S1.以丁香酚和丙烯酸甲酯为原料，通过烯烃复分解反应生成4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑ꢀ
甲氧基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸甲酯；
[0015]S2.将步骤S1生成的4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸甲酯经过水解反应引入羧基，生成4
‑
(4羟基
‑3‑
甲氨基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸；
[0016]S3.将步骤S2生成的4
‑
(4羟基
‑3‑
甲氨基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸通过活泼酯法偶联乙二胺异硫氰酸荧光素，生成式I所示结构的丁香酚荧光示踪物。
[0017]更优选地，步骤S1中，所述烯烃复分解反应的反应溶剂为二氯甲烷，反应温度为70～80℃，反应时间为10～24h，反应中采用1，3
‑
双(2，4，6三甲基苯基)
‑2‑
(咪唑烷亚基)(二氯苯亚甲基)(三环己基膦)钌作为反应催化剂；所述丁香酚、丙烯酸甲酯和反应催化剂的物质的量之比为1：3.2～4：0.06～0.08。
[0018]更优选地，步骤S2中，所述水解反应用氢氧化钠和4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸甲酯反应，反应溶剂为乙醇，反应温度为70～80℃，反应时间为 5～12h；所述4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸甲酯和氢氧化钠的物质的量之比为1：2.8～5；水解反应结束后，用盐酸和乙酸乙酯进行萃取，萃取后进行干燥。
[0019]进一步优选地，所述萃取后进行干燥为：用无水硫酸钠进行干燥。
[0020]更优选地，步骤S3中，所述活泼酯法的偶联剂为N，N
’‑
二环己基碳二亚胺和N
‑
羟基琥珀亚酰胺；所述乙二胺异硫氰酸荧光素、4
‑
(4羟基
‑3‑
甲氨基苯基)
ꢀ‑
丁
‑2‑
烯酸和偶联剂的物质的量之比为1：2.8～5：11.2～20。
[0021]更优选地，步骤S3中，还需要对活泼酯法获得的产物用制备型薄层层析板进行分离纯化。
[0022]进一步优选地，分离纯化过程中展开剂为体积比为氯仿：甲醇＝4：1的混合溶液。
[0023]优选地，所述化合物的制备反应式如下所示。
[0024][0025]一种丁香酚荧光偏振免疫检测法，所述荧光偏振免疫检测法包括以下步骤：
[0026]S1.向荧光微孔板的荧光微孔中分别加入浓度从0.001ng/mL～10000ng/mL，不少于8个浓度梯度的丁香酚标准溶液，随后依次加入权利要求1所述的化合物和丁香酚特异性抗体，混匀得到混合溶液，将混合溶液充分反应；
[0027]S2.使用多功能荧光偏振仪读取微孔板中充分反应后的混合溶液荧光偏振值；
[0028]S3.建立丁香酚荧光偏振免疫检测法的标准曲线；
[0029]S4.重复步骤S1和步骤S2，将步骤S1中的丁香酚标准溶液换为待测样品，将测得的荧光偏振值与步骤S3中建立的标准曲线比对，即得待测样品中的丁香酚含量。
[0030]优选地，所述丁香酚特异性抗体通过Eul
‑4‑
Tbl
‑
BSA免疫动物得到，所述Eul
‑4‑
Tbl
‑
BSA通过结构式如式(II)所示的Eul
‑4‑
Tbl偶联载体蛋白BSA得到，
[0031][0032]优选地，步骤S1中，所述丁香酚荧光示踪物的浓度为1～5nmol/L，丁香酚特异性抗体浓度为0.5～5μg/mL，充分反应时间为1～15min。
[0033]更优选地，步骤S1中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式(I)所示，2.权利要求1所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.以丁香酚和丙烯酸甲酯为原料，通过烯烃复分解反应生成4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸甲酯；S2.将步骤S1生成的4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸甲酯经过水解反应引入羧基，生成4
‑
(4羟基
‑3‑
甲氨基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸；S3.将步骤S2生成的4
‑
(4羟基
‑3‑
甲氨基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸通过活泼酯法偶联乙二胺异硫氰酸荧光素，生成式I所示结构的丁香酚荧光示踪物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤S1中，所述烯烃复分解反应的反应溶剂为二氯甲烷，反应温度为70～80℃，反应时间为10～24h，反应中采用1，3
‑
双(2，4，6三甲基苯基)
‑2‑
(咪唑烷亚基)(二氯苯亚甲基)(三环己基膦)钌作为反应催化剂；所述丁香酚、丙烯酸甲酯和反应催化剂的物质的量之比为1：3.2～4：0.06～0.08。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤S2中，所述水解反应用氢氧化钠和4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
丁
‑2‑
烯酸甲酯反应，反应溶剂为乙醇，反应温度为70～80℃，反应时间为5～12h；所述4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
丁<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，王旭峰，黎智广，关婉琪，蔡楠，李惠青，黄珂，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：