本发明专利技术公开了一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术提供的腈水合酶突变体Str.t NHase
【技术实现步骤摘要】
一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用
[0001]本申请是针对原申请号为：CN202011307426.3，原申请日为2020年11月20日，专利技术名称为一种腈水合酶突变体及其应用的分案申请。
[0002]本专利技术涉及一种腈水合酶突变体及其在制备酰胺类化合物中的应用，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
[0003]腈水合酶(NHase)可用于催化3
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氰基吡啶生成药用价值更高的尼克酰胺，尼克酰胺又名烟酰胺，是一种维生素，已经被广泛的用于饲料、食品、制药等行业。烟酰胺市场需求量很大，预计每年需要2000多吨，但目前我国尼克酰胺的生产水平不高，规模不大，需要大量的进口，约1000吨/年。因此，将NHase用于尼克酰胺的生产有很大潜力。但是，该反应是一个放热的过程，所以生产过程中高温会影响酶活的发挥，主要是温度高，影响酶的结构，导致酶活下降，进而导致了大量的能耗，提高了生产成本。目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成烟酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，生产效率不高，烟酰胺产量最高为162g/L，而丙烯酰胺产量最高为300g/L。目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/L。
[0004]腈水合酶的不稳定性还体现在对底物(腈类有机物)的耐受性差，容易使腈水合酶失活；例如在丙烯酰胺的酶法制备过程中，由于腈水合酶对底物的耐受性不高，导致终产物丙烯酰胺只能维持较低的水平，给后续的丙烯酰胺浓缩工艺带来影响。随着市场的不断拓展，酰胺类化合物的需求也日益剧增，因此如何提高腈水合酶的底物耐受性已成为研究重点。获得一株有底物耐受性好、催化效率高的腈水合酶对于酰胺类工业化生产具有重要的应用价值。
技术实现思路
[0005]本专利技术旨在提供一种稳定性、酶活都提高的腈水合酶突变体并构建可以高性能催化多种腈类底物的酶工具箱。
[0006]本专利技术首先提供了一种腈水合酶突变体，所述突变体为(1)
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(5)任一：
[0007](1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位亮氨酸突变得到的；
[0008](2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位苯丙氨酸突变得到的；
[0009](3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位酪氨酸突变得到的；
[0010](4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位亮氨酸突变得到的；
[0011](5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位苯丙氨酸突变得到的。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为(1)
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(5)任一：
[0013](1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βL37P，βL37K，βL37D，βL37A，βL37F；
[0014](2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βF41P，βF41K，βF41D，βF41A；
[0015](3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βY46P，βY46K，βY46D，βY46A，βY46F；
[0016](4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βL48P，βL48K，βL48D，βL48A，βL48F；
[0017](5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βF51P，βF51K，βF51D，βP51A。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述腈水合酶来源于嗜热链霉菌(Streptomyces thermoautotrophicus)。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述腈水合酶β亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0020]本专利技术还提供了编码上述突变体的基因。
[0021]本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒以pET
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24a为出发质粒。
[0023]本专利技术还提供了携带上述基因，或上述重组质粒的重组细胞。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌E.coli BL21。
[0027]本专利技术还提供了一种提高腈水合酶耐受性的方法，所述方法为，按照下述(1)
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(5)任一方法对腈水合酶进行突变：
[0028](1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
[0029](2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任意一种；
[0030](3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
[0031](4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
[0032](5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任意一种。
[0033]在本专利技术的一种实施方式中，所述耐受性为底物耐受性，所述底物为腈类化合物。
[0034]在本专利技术的一种实施方式中，所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、苯甲腈、2
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氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上。
[0035]本专利技术还提供一种提高腈水合酶活性的方法，所述方法为，按照下述(1)
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(5)任一方法对腈水合酶进行突变：
[0036](1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的任意一种；
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，野生腈水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述腈水合酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的任一种得到的。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述的重组质粒的重组细胞。5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以大肠杆菌为表达宿主。6.一种提高腈水合酶对腈类化合物耐受性的方法，其特征在于，野生腈水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述方法为，按照下述方法对腈水合酶进行突变：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸；所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、2
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氰基吡嗪腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为赖氨酸；所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、2
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氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为天冬氨酸；所述腈类化合物为烟腈、2
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氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈中的一种或一种以上或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为丙氨酸；所述腈类化合物为烟腈、丙烯腈、正戊腈、肉桂腈中的一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，郭军玲，程中一，刘中美，崔文璟，周丽，韩来闯，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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