【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成RNA分子的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年11月27日提交的美国临时专利申请序列号62/941,174的权益。其全部内容通过引用并入本文。
[0003]本公开一般涉及分子生物学和生物
，包括核酸的合成和用于合成与核酸内切酶相关的RNA分子(也称为向导RNA)的方法。
技术介绍
[0004]使用CRISPR(常间回文重复序列丛集)
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Cas(CRISPR相关的)系统的RNA引导的、靶向DNA的原理来靶向DNA已在本领域中被广泛采用。CRISPR
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Cas系统可分为两大类，1类系统利用多个Cas蛋白复合体(诸如I、III和IV类CRISPR
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Cas系统)，2类系统利用单个Cas蛋白(诸如II、V和VI类CRISPR
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Cas系统)。基于II类CRISPR
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Cas的系统已用于基因组编辑，并且需要由可定制的向导RNA(gRNA)引导的Cas多肽或其变体用于可编程的DNA靶向。基于II类CRISPR
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Cas的系统的向导RNA通常长度为30
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130个核苷酸(Chylinski等人(2013)RNABiology,10(5):726
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737)。
[0005]合成gRNA的方法包括，例如，外源质粒的细胞内转录或使用亚磷酰胺化学法的固相合成。直接化学合成gRNA允许掺入化学修饰，从而增加RNA的化学稳定性、降低...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种合成向导RNA(gRNA)的方法，所述方法包括：提供第一RNA片段，其包含含有5'磷酸酯部分的末端区域，和第二RNA片段，其包含含有3'羟基基团的末端区域，其中，所述第一RNA片段、所述第二RNA片段或两者至少包含可以与RNA引导的核酸内切酶结合的序列的一部分；提供夹板寡核苷酸，其包含在末端区域与第一RNA片段互补的第一部分，所述末端区域包含5'磷酸酯部分和在末端区域与第二RNA片段互补的第二部分，所述末端区域包含3'羟基基团；将所述第一RNA片段、所述第二RNA片段和所述夹板寡核苷酸杂交在一起形成复合体；以及在存在于所述RNA复合体之间的连接位点处使用连接酶连接所述第一和所述第二RNA片段，从而合成gRNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一和第二RNA片段的长度分别为10至90个核苷酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第二RNA片段的所述长度为40个核苷酸或更少。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中，所述5'磷酸酯部分是5'
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磷酸酯或5'
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硫代磷酸酯。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中，所述连接酶是T4 DNA连接酶、T4RNA连接酶I或T4 RNA连接酶II。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中，所述夹板寡核苷酸是DNA或RNA寡核苷酸。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中，所述夹板寡核苷酸的长度为20至100个核苷酸。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中，所述夹板寡核苷酸被附接到固体载体。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中，所述gRNA的长度为30至160个核苷酸。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中，所述gRNA包含与在靶DNA中的序列互补的序列。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述靶DNA是哺乳动物DNA。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述靶DNA是人DNA。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中，所述连接位点对应于在所述合成的gRNA中茎环结构的四环部分中的位点。14.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中，所述连接位点对应于在所述合成的gRNA中茎环结构的螺旋部分中的位点。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中，所述第一RNA片段、所述第二RNA片段或两者包含至少一个二级结构，并且其中将所述第一RNA片段、所述第二RNA片段和所述夹板寡核苷酸杂交产生比具有最低自由能的二级结构的自由能更低的自由能。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其包括连接三个或更多个RNA片段。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中，提供所述第一和第二RNA片段包括
通过酶促合成或亚磷酰胺化学法合成所述第一和第二RNA片段。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第二RNA片段以5'至3'或3'至5'方向合成。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，提供所述第一和第二RNA片段包括在合成后纯化所述第一和第二片段。20.根据权利要求1
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19中任一项所述的方法，其中，提供所述夹板寡核苷酸包括通过酶促合成或亚磷酰胺化学法合成所述夹板寡核苷酸。21.根据权利要求20所述的方法，其中，提供夹板寡核苷酸包括在合成后纯化夹板寡核苷酸。22.根据权利要求19或21所述的方法，其中，纯化包括用色谱方法纯化。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述色谱方法为反相HPLC、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法或聚丙烯酰胺凝胶纯化或其任意组合。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中，所述第一RNA片段、所述第二RNA片段或两者在所述RNA主链中包含至少一个修饰。25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述修饰选自由以下组成的组：2'甲氧基(2'OMe)、2'氟(2'氟)、2'
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O
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甲氧基
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乙基(MOE)、锁核酸(LNA)、未锁核酸(UNA)、桥接核酸、2'脱氧核酸(DNA)和肽核酸(PNA)。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的方法，其中，所述第一RNA片段、所述第二RNA片段或两者包含至少一个碱基修饰。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述碱基修饰选自由以下组成的组：2
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氨基嘌呤、肌苷、胸腺嘧啶、2,6
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二氨基嘌呤、2
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嘧啶酮和5
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甲基胞嘧啶。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的方法，其中，所述第一RNA片段、所述第二RNA片段或两者包含至少一个硫代磷酸酯键。29.根据权利要求1
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28中任一项所述的方法，其中，杂交包含在溶液中杂交。30.根据权利要求29所述的方法，其中，在所述溶液中所述夹板寡核苷酸的浓度、所述第一RNA片段的浓度和所述第二RNA片段的浓度大致相等。31.根据权利要求1
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30中任一项所述的方法，其中，连接所述第一和第二RNA片段在15℃
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45℃下进行。32.根据权利要求31所述的方法，其中，连接所述第一和第二RNA片段在约37℃下进行。33.根据权利要求1
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32中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二RNA片段的连接进行约0.1至约48小时。34.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中，连接所述第一和第二RNA片段还包括使用蛋白酶或螯合剂。35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述螯合剂是EDTA、EGTA或两者的组合。36.根据权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中，连接所述第一和第二RNA片段还包括使用一种或多种拥挤剂。37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述一种或多种拥挤剂包括聚乙二醇(PEG)、乙二醇、葡聚糖或其任何组合。38.根据权利要求1
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37中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二RNA片段的连接进行到至少10％的完成度。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述第一和第二RNA片段的连接进行到至少90％的完成度。40.一种合成向导RNA(gRNA)的方法，所述方法包括提供：(a)第一RNA片段，其包含含有3'羟基基团的末端区域；(b)第二RNA片段，其包含含有5'磷酸酯部分的第一末端区域和含有3'羟基基团的第二末端区域；(c)第三RNA片段，其包含含有5'磷酸酯部分末端区域；(d)第一夹板寡核苷酸，其包含(i)与包含所述第一RNA片段的3'羟基基团的所述末端区域互补的第一部分；(ii)与包含所述第二RNA片段的5'磷酸酯部分的所述第一末端区域互补的第二部分；(e)第二夹板寡核苷酸，其包含(i)与包含所述第二RNA片段的所述3'羟基基团的所述第二末端区域互补的第一部分；(ii)与包含所述第三RNA片段的所述5'磷酸酯部分的所述末端区域互补的第二部分；和(f)连接酶，其中，将所述第一、第二和第三RNA片段与所述第一和第二夹板寡核苷酸杂交导致复合体的形成，该复合体具有存在于所述第一RNA片段的所述3'羟基基团和所述第二RNA片段的所述5'磷酸酯基团之间的第一连接位点，以及存在于所述第二RNA片段的所述3'羟基基团和所述第三RNA片段的所述5'磷酸酯基团之间的第二连接位点；和其中，所述连接酶引起所述第一和第二RNA片段在所述第一连接位点的连接，以及所述第二和第三RNA片段在所述第二连接位点的连接，从而合成gRNA。41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述gRNA包含5'至3'的通过第一磷酸二酯键与所述第二RNA片段连接的所述第一RNA片段，以及通过第二磷酸二酯键与所述第三RNA片段连接的所述第二RNA片段。42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述第一磷酸二酯键在所述第一RNA片段的所述3'羟基基团和所述第二RNA片段的所述5'磷酸基之间形成，并且其中所述第二磷酸二酯键在所述第二RNA片段的所述3'羟基基团和第三RNA片段的所述5'磷酸酯基团之间形成。43.根据权利要求40
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42中任一项所述的方法，其中，所述gRNA是单分子gRNA(sgRNA)。44.根据权利要求40
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43中任一项所述的方法，其中，所述gRNA的长度为约30至约160个核苷酸。45.根据权利要求40
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44中任一项所述的方法，其中，所述第一连接位点对应于在第一茎环结构中的位点，其中所述第一茎环结构由在所述gRNA中的最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列的杂交形成。46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述第一茎环结构中的所述位点在四环部分或螺旋部分中。47.根据权利要求40
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46中任一项所述的方法，其中，所述第二连接位点对应于第二茎环结构中的位点，其中所述第二茎环结构存在于所述gRNA的tracrRNA序列中。48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述第二茎环结构中的所述位点在四环部分或螺旋部分中。49.根据权利要求40
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48中任一项所述的方法，其中，所述第一RNA片段、所述第二RNA片
段和/或所述第三RNA片段包含至少一个二级结构，并且其中所述第一、第二和第三RNA片段和所述第一和第二夹板寡核苷酸杂交形成的复合体的自由能低于具有最低自由能的二级结构的自由能。50.一种合成与RNA引导的核酸内切酶联用的单分子向导RNA(sgRNA)的方法，所述方法包括：提供在第一RNA片段、第二RNA片段、第三RNA片段、第一夹板寡核苷酸和第二夹板寡核苷酸之间形成的复合体；和连接酶，其中(a)所述第一RNA片段包含(i)包含3'羟基基团的末端区域；(b)所述第二RNA片段包含(i)包含5'磷酸酯部分的第一末端区域，和(ii)包含3'羟基基团的第二末端区域；(c)所述第三RNA片段包含(i)包含5'磷酸酯部分的末端区域；(d)所述第一夹板寡核苷酸包含(i)与包含所述第一RNA片段的所述3'羟基基团的所述末端区域互补的第一部分，和(ii)与包含所述第二RNA片段的所述5'磷酸酯部分的所述第一末端区域互补的第二部分；和(e)所述第二夹板寡核苷酸包含(i)与包含所述第二RNA片段的所述3'羟基基团的所述第二末端区域互补的第一部分，和(ii)与包含所述第三RNA片段的所述5'磷酸酯部分的所述末端区域互补的第二部分，其中，所述复合体是通过(a)(i)和(d)(i)、(b)(i)和(d)(ii)、(b)(ii)和(e)(i)、以及(c)(i)和(e)(ii)的杂交形成的，其中，所述复合体具有存在于所述第一RNA片段的所述3'羟基基团和所述第二RNA片段的所述5'磷酸酯基团之间的第一连接位点，以及存在于所述第二RNA片段的所述3'羟基基团和所述第三RNA片段的所述5'磷酸酯基团之间的第二连接位点，其中，所述连接酶引起在所述第一连接位点的连接和在所述第二连接位点的连接以形成sgRNA，其包含从5'到3'：间隔区序列和结合RNA引导的核酸内切酶的不变序列；所述不变序列包含在crRNA重复序列和tracrRNA抗重复序列之间形成的茎环，以及包含至少一个茎环的3'tracrRNA序列，从而合成与RNA引导的核酸内切酶联用的sgRNA。51.根据权利要求50所述的方法，其中，第一连接位点对应于在所述crRNA重复序列和所述tracrRNA抗重复序列之间形成的茎环中的位点。52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述第一连接位点对应于在所述茎环的所述5'茎中的，在所述茎环的所述四环中的，或在所述茎环的所述3'茎中的位点。53.根据权利要求50
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53中任一项所述的方法，其中，所述3'tracrRNA序列包含第一茎环、第二茎环和第三茎环。54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述第二连接位点对应于在所述第一茎环中的、在所述第二茎环中的或在所述第三茎环中的位点。55.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述第二连接位点对应于所述第二茎环中的位点，其中所述位点是在所述第二茎环的所述5'茎中的、在所述第二茎环的所述四环中的位点，或在所述第二茎环的所述3'茎中的位点。56.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述第二连接位点对应于与所述第二茎环的5'碱基相邻或与所述第二茎环的所述3'碱基相邻的位点。57.根据权利要求50
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56中任一项所述的方法，其中，所述第一RNA片段包含是5'所述第
一连接位点的核苷酸序列。58.根据权利要求5...
【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：拜尔健康护理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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