一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。所述五元脂质纳米颗粒的原料包含阳离子脂质、聚合(β

【技术实现步骤摘要】
一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及化学制药以及生物
，涉及核酸递送系统，具体涉及一种高稳定性肺靶向的聚合物
‑
脂质纳米颗粒的制备方法及其在核酸递送中的应用。

技术介绍

[0002]新冠肺炎疫情的爆发，让人们意识到肺部传染病的严重性。而除传染病之外，肺部其他相关疾病，如肺癌和遗传性罕见疾病，也缺乏有效的治疗手段。在新冠肺炎期间，一种新型的包裹在脂质纳米颗粒(LNP)中的mRNA疫苗表现出高达95％的保护功效，这是第一个获得FDA紧急使用许可的mRNA疫苗。除此之外，基于脂质纳米颗粒(LNP)的mRNA可以通过编码基因编辑的工具来根治遗传性疾病，也可以通过编码肿瘤抗原、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体等实现肿瘤的免疫治疗。因此，将mRNA
‑
LNP制剂应用于肺相关疾病的治疗无疑具有巨大的潜力和意义。
[0003]目前有少数研究提出了mRNA核酸肺靶向的策略，如SORT提出带正电荷的纳米粒可以实现肺的递送。然而，目前LNP的应用仍面临许多问题，其中储存的稳定性是限制其广泛临床应用的主要缺点，稳定性低的LNP制剂在储存和运输上会有巨大的经济障碍。因此LNP的不稳定性是一个亟待解决的问题。目前影响mRNA
‑
LNPs不稳定性的主要因素如下，即mRNA的不稳定性和LNP的不稳定性：
[0004]1)在水存在的情况下mRNA中的化学成分容易氧化和水解。例如，mRNA中磷酸酯键上的2'OH基团攻击p
‑
o5'酯键，导致mRNA链断裂。这个过程需要水，可以由酸或者碱催化。2)由于化学材料的降解，mRNA与化学脂质的作用力变弱，mRNA泄漏。泄露的裸mRNA难以被细胞吸收，而且会迅速降解；3)由于水中纳米颗粒之间的斥力不足，脂质纳米颗粒有发生聚集、融合和渗漏的倾向。

技术实现思路

[0005]为了在体内有效发挥作用，脂质纳米颗粒
‑
mRNA需要克服多种细胞外和细胞内屏障。首先，mRNA需要被脂质纳米颗粒成功包裹。其次，脂质纳米颗粒需要到达靶组织，然后被靶细胞内化。最重要的是，mRNA必须逃脱核内体，翻译成功能性蛋白质。另外，该制剂在临床应用时，最好可以在4℃条件下长期储存，以减少在运输的贮存过程中的经济负担。
[0006]总的来说，纳米粒子的物理化学特性是后续有效性评估的基础。例如，较高的核酸包封率是决定有效转染和适宜粒径的关键因素；Zeta电位也在一定程度上影响其毒性和体内分散能力。Zeta电位越高，生理条件下红细胞的溶血能力越强，毒性也越大。而PDI则在一定程度上反映了处方的均一性和完善性。合适的纳米粒粒径及电位会降低体内栓塞的概率，促进体内深部组织的穿透，提高细胞的摄取及转染效率。
[0007]本专利技术人创新性地发现PBAE和阳离子脂质的加入可以增加FNP的稳定性。
[0008]例如，本专利技术采用了经典的阳离子脂质DOTAP，它具有很强的正电荷来阻止分子间的聚集；其次，首次将一种辅助聚合物聚β
‑
氨基酯(PBAE)引入到传统的四组分阳离子LNP配
方中组成一种新型的五元纳米颗粒FNP。PBAE作为一种可质子化的含多重氮的阳离子材料，进一步增强了对mRNA的包封，防止mRNA泄漏以及减少冻干过程中因结晶和真空脱水产生的不利影响，进一步保障了纳米粒的稳定性。这两种组分的加入，使纳米粒具有高稳定性，可以很好地耐受冷冻干燥过程，进而可以通过冻干去除水分对mRNA和脂质材料水解的影响。
[0009]本专利技术构建了不同侧链长度、不同聚合度的新型PBAE聚合物库，并进一步探讨了其体内、体外构效关系。PBAE的碳链长度越接近C16，递送效率越高；PBAE的聚合度越高，递送效率越高。基于上述成分的新型辅助聚合物的FNP经体内筛选出具有特异、高效的肺靶向PBAE材料，经冷冻干燥后在4℃下的稳定时间超过3个月。
[0010]此外，本专利技术通过质谱分析研究了FNP的蛋白冠组成，并进一步研究了其肺靶向性机制。发现在FNP中，玻连蛋白高度富集。首次采用小鼠肺原代微血管内皮细胞，验证玻连蛋白通过与肺内皮细胞整合素受体α
v
β3结合，介导FNP的肺特异性靶向。
[0011]本专利技术主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0012]本专利技术的目的在于提供一种能够有效包封核酸并能被细胞高效摄取后快速逃逸出溶酶体，最终实现体内目的基因高效表达的肺靶向核酸递送系统，同时该系统具有高稳定性，经冷冻干燥后能够在4℃的条件下长期储存。
[0013]为实现对于核酸的有效包封并提高细胞摄取和溶酶体逃逸效率的目的，本专利技术公开了以下技术方案：一种在脂质纳米颗粒中添加辅助聚合物PBAE和阳离子脂质的聚合物
‑
脂质纳米颗粒，该纳米粒由聚合物PBAE、阳离子脂质、甾醇、磷脂、PEG脂质和一种或多种核酸分子组成，所述的核酸分子包裹在脂质和聚合物中形成层层包裹的结构中。
[0014]本专利技术首次将一种辅助聚合物聚β
‑
氨基酯(PBAE)引入到传统的四组分阳离子LNP配方中组成一种新型的五元纳米颗粒FNP。PBAE作为一种可质子化的含多重氮的阳离子材料，进一步增强了对mRNA的包封。
[0015]本专利技术提供一种聚合(β
‑
氨基酯)(PBAE)，其包含式(I)；
[0016][0017]其中：
[0018]R1独立地是含有或者不含有羟基的脂肪链，R2独立地是包含伯胺、仲胺或叔胺的端基单体，R包含直链或支链的C1‑
C
50
亚烃基链，其可进一步包含一个或更多个杂原子或一个或更多个碳环基团、杂环基团或芳族基团；
[0019]m为1
‑
15，n为3
‑
45，x为1
‑
13。
[0020]本专利技术中，所述R1优选独立地为
[0021]所述R2优选独立地为
[0022][0023]所述R优选独立地为
[0024]或者
[0025]所述PBAE的制备方法可为本领域常规，例如其制备方法包含：将R1、R2、R以及烷基胺混合在一起进行迈克尔加成反应。
[0026]本专利技术还提供一种五元脂质纳米颗粒，其原料包含阳离子脂质、如上所述的聚合(β
‑
氨基酯)、甾醇、磷脂以及PEG脂质。
[0027]当五元脂质纳米颗粒作为核酸递送系统时，其还可包含核酸分子。
[0028]本专利技术中，所述阳离子脂质与所述PBAE摩尔比较佳地为(2.5～40):1。
[0029]本专利技术中，所述阳离子脂质与所述PBAE质量与所述核酸分子的相对用量较佳地为(10～80):1。
[0030]本专利技术中，所述磷脂与所述甾醇的摩尔比较佳地为(0.2～1)：1。
[0031]本专利技术中，所述磷脂与所述PEG脂质的摩尔比较佳地为(5～20):1。
[0032]在本专利技术一较本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种聚合(β
‑
氨基酯)，其特征在于，其包含式(I)；其中：R1独立地是含有或者不含有羟基的脂肪链；R2独立地是包含伯胺、仲胺或叔胺的端基单体；R包含直链或支链的C1‑
C
50
亚烃基链，其可进一步包含一个或更多个杂原子或一个或更多个碳环基团、杂环基团或芳族基团；m为1
‑
15，n为3
‑
45，x为1
‑
13。2.如权利要求1所述的聚合(β
‑
氨基酯)，其特征在于，其中：所述R1独立地为和/或，所述R2独立地为和/或所述R独立地为或者3.如权利要求1或2所述的聚合(β
‑
氨基酯)，其特征在于，其制备方法包含：将R1、R2、R以及烷基胺混合在一起进行迈克尔加成反应。4.一种五元脂质纳米颗粒，其特征在于，其原料包含阳离子脂质、如权利要求1～3任一项所述的聚合(β
‑
氨基酯)、甾醇、磷脂、PEG脂质以及核酸分子。5.如权利要求4所述的五元脂质纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子脂质与所述PBAE摩尔比为(2.5～40):1；和/或，所述阳离子脂质与所述PBAE质量与所述核酸分子的相对用量为(10～80):1；和/或，所述磷脂、所述甾醇、所述PEG脂质的摩尔比为磷脂:甾醇＝(0.2～1):1；磷脂：PEG脂质＝(5～20):1；
和/或，n:m的比为7:3；和/或，x为3～11。6.如权利要求4所述的五元脂质纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DODAB、DDAB以及D...

【专利技术属性】
技术研发人员：李剑峰，曹燕，何宗兴，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：