本发明专利技术提供了一种基于DNA马达的检测赭曲霉毒素A的方法。该方法基于自主运行的DNA马达，提供了一种一步扩增的程序化自动检测赭曲霉毒素A的方法。赭曲霉毒素A可与适体结合并诱导分子发夹结构的打开。然后，镁离子特异的DNA酶可以在金纳米颗粒上循环剪切荧光团标记的DNA，从而引起DNA马达的自主性和过程性运动。最后，切割的荧光团标记的DNA片段可以从金纳米颗粒表面离开，从而导致荧光信号的显著恢复。良好的线性范围是从0.01到5nM，检测限为2pM。该方法是自动进行的，整个过程只需要一步操作即可，在食品安全监管或赭曲霉毒素A生物成像方面显示出巨大潜力。成像方面显示出巨大潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA马达的检测赫曲霉毒素A的方法
[0001]本专利技术涉及赭曲霉毒素A的检测领域，特别是基于DNA马达和荧光的赭曲霉毒素A检测方法领域。
技术介绍
[0002]赭曲霉毒素A是一种有毒代谢产物，主要由几种曲霉和青霉菌产生。在不适当的存储或加工过程中，赭曲霉毒素A可能会污染农产品。由于其化学稳定性和长的半衰期，它已在食品或饲料以及肉制品和人血血清中被广泛发现。赭曲霉毒素A也被归类为可能的人类致癌物。一些国际机构正在尝试对饲料，生食品和加工食品中的赭曲霉毒素A浓度进行安全的法律限制。为了进一步确保食品安全，必须开发一种简单而准确的方法来检测其在食品和饲料中的存在。
[0003]现有技术已经在设备齐全的实验室中建立了许多用于赭曲霉毒素A检测的标准方法，包括HPLC，GC
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MS/MS，HPLC
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MS/MS和ELISA。这些方法通常被视为检测各种真实食品中赭曲霉毒素A的准确和灵敏的方法。但是，这些技术需要昂贵的仪器，费时的预处理和经验丰富的操作员。
[0004]近年来，适体作为一种新兴的分子识别元件已经引起了人们的广泛关注。适体是功能性单链DNA，可以以高特异性和强结合亲和力与各种靶标结合，包括小离子，小分子，核酸，蛋白质甚至细胞。适体由于其独特的优点而显示出优于抗体的优势，例如易于化学合成，易于修饰和理想的储存条件，已通过与比色法，荧光，电化学，SERS等结合用于目标物检测。
[0005]为了进一步提高基于适体的检测方法的敏感性，已经开发了多种信号放大方法，包括纳米材料，酶基或无酶放大DNA技术等。基于DNA马达的扩增策略是最有前途的工具之一。合成DNA马达是一种用于DNA行走的三维DNA纳米机器，可以模仿细胞中的天然蛋白质马达，并在各种轨道上进行连续性和自主性运动。此外，DNA马达可以通过脱氧核酶沿轨道切割DNA底物，从DNA马达释放多种底物，从而导致强大的信号放大作用。目前，它已被用于检测DNA，miRNA，蛋白质，细胞等。但是以简单的操作和高灵敏度检测食品样品中的赭曲霉毒素A仍然具有挑战性。
技术实现思路
[0006]为解决上述问题，本专利技术提供一种基于DNA马达的检测赫曲霉毒素A的方法。
[0007]本专利技术包括如下步骤：
[0008]1)合成金纳米颗粒；
[0009]2)DNA马达的制备：将荧光团标记的底物链DNA(S
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DNA)和酶链DNA(E
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DNA)锁定的适体分子发卡结构与金纳米颗粒孵育过夜，根据现有技术对荧光团标记的S
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DNA的表面浓度进行定量，DNA马达的制备：将荧光团标记的底物链DNA和酶链DNA锁定的适体分子发卡与金纳米颗粒孵育过夜，根据现有技术对荧光团标记的S
‑
DNA的表面浓度进行定量，其中酶链
DNA锁定的适体分子发卡序列
[0010]5'HS
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TTTTTTTTTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAACTATTTTTTTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAAATAGTTGTCCG
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3'，荧光团标记的底物链DNA序列：5
’
HS
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TTTTTTTTTTTTTTTACTATrAGGAAGAGAT
‑
FAM 3
’
；
[0011]3)检测赭曲霉毒素A信号：将含有赭曲霉毒素A的被测样品与DNA马达在PBS溶液中孵育，测定荧光信号；
[0012]4)定量计算：使用在517nm的荧光强度通过标准曲线法对赭曲霉毒素A进行定量。
[0013]优选的，上述步骤2)具体为：在室温下，将1μM荧光团标记的S
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DNA和60nM E
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DNA锁定的适体分子发卡与10nM金纳米颗粒孵育过夜。0.05％的Tween 20用于防止非特异性吸附。在12,000rpm离心10分钟后，将沉淀物洗涤并重新分散在10mM PBS溶液(pH 7.5)中。最后，根据现有技术对荧光团标记的S
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DNA的表面浓度进行定量。。
[0014]优选的上述步骤3)具体为：将20μL赭曲霉毒素A样品与300μLDNA马达在10mM MgCl2和0.1M NaCl的10mM PBS(pH 7.5)中孵育。温育80分钟。
[0015]优选的，上述步骤4)具体为：荧光光谱从500nm扫描至600nm。然后，使用在517nm的荧光强度通过标准曲线法对赭曲霉毒素A进行定量。
[0016]本专利技术提供了开发了一种可编程的，自主且自动运行的DNA马达，用于一步检测赭曲霉毒素A。赭曲霉毒素A可以与apatmer结合，然后导致分子发夹张开。打开的E
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DNA与金纳米上的底物链结合形成DNA酶结构。DNA马达自动催化DNA酶对底物链的切割。它可以导致荧光标记的DNA链从金纳米颗粒持续释放。因此，荧光强度被显著恢复。荧光信号可以用于赭曲霉毒素A的定量。这种方法既简单又灵敏，只需要一步操作即可进行赭曲霉毒素A检测。重要的是，这种DNA马达模型可以在组织或活细胞中精确定位和定量赭曲霉毒素A。此外，该方法已成功应用于不同食品基质中赭曲霉毒素A的检测，具有良好的特异性和选择性。
附图说明
[0017]图1为本专利技术检测过程示意图。
[0018]图2为不同样品的荧光强度：(1)DNA马达+镁离子(无赭曲霉毒素A)，(2)DNA马达+赭曲霉毒素A(无镁离子)，(3)DNA马达+赭曲霉毒素A+镁离子(荧光团标记的S
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DNA：E
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DNA锁定适体分子发卡＝1：1)，(4)DNA马达+赭曲霉毒素A+镁离子(孵育40分钟)，(5)带有E'
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DNA+赭曲霉毒素A+镁离子的DNA马达，(6)DNA马达+赭曲霉毒素A+镁离子。
[0019]图3(A)为在优化的实验条件下，此方法对不同浓度的赭曲霉毒素A(0.01、0.5、1、2、5、10、15nM)的荧光发射光谱。图3(B)荧光强度和赭曲霉毒素A浓度之间的关系。插图：荧光强度与赭曲霉毒素A浓度的校准曲线。图3(C)该方法对赭曲霉毒素A(1nM和5nM)的选择性和抗干扰性。
具体实施例
[0020]下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的说明。
[0021]准备材料和试剂
[0022]准备霉菌毒素(包括赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B(OTB)，玉米赤霉烯酮(ZEA)，脱氧新萘烯醇(DON)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，黄曲霉毒素M1(AFM1))、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、四氯
金酸、柠檬酸钠和6
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巯基己醇(MCH)、超纯水、DNA序列(酶链DNA(E
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DNA)适体分子发卡序列5'HS
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TTTTTTTTTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种赭曲霉毒素A检测方法，包括如下步骤：1)合成金纳米颗粒；2)DNA马达的制备：将荧光团标记的底物链DNA和酶链DNA锁定的适体分子发卡与金纳米颗粒孵育过夜，根据现有技术对荧光团标记的底物链DNA的表面浓度进行定量，其中酶链DNA锁定的适体分子发卡序列：5'HS
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TTTTTTTTTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAACTATTTTTTTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAAATAGTTGTCCG
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3'，荧光团标记的底物链DNA序列：5
’
HS
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TTTTTTTTTTTTTTTACTATrAGGAAGAGAT
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FAM 3
’
；3)检测赭曲霉毒素A信号：将含有赭曲霉毒素A的被测样品与步骤2)制备的DNA马达在PBS溶液中孵育，测定荧光信号；4)定量...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽珠，李煜婷，许亚玲，张佳枫，吴戈，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：
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