一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及狼疮脑病研究领域，具体而言，涉及一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法。本发明专利技术所述方法是通过向小鼠脑内注射MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法


[0001]本专利技术涉及狼疮脑病研究领域或小鼠模型构建领域，具体而言，涉及一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法。

技术介绍

[0002]系统性红斑狼疮会导致多种神经精神综合征的发生，包括抑郁、认知功能损害、癫痫、脑血管病等狼疮脑病相关症状。狼疮脑病是系统性红斑狼疮患者预后不良的重要原因，目前仍然缺乏有效防治狼疮脑病的药物和策略。因此，狼疮脑病的研究至关重要，而建立有效的狼疮脑病小鼠模型是研究狼疮脑病的基础和关键环节。
[0003]目前狼疮脑病动物模型主要分为两大类，一类是人工诱导型，一类是自发型。人工诱导型动物模型主要采用自身抗体、抗原或降植烷、咪喹莫特等生物试剂注射入小鼠体内进行诱导狼疮脑病的发生。自发型动物模型包括MRL/MpJ
‑
Faslpr(MRL/Lpr)、BxSB、NZB
×
NZW F1(NZB/W F1)三种。
[0004]上述动物模型对狼疮脑病的研究做出了巨大的贡献，但仍存在一些缺陷：一、无论是人工诱导型还是自发型，均存在造模周期过长的情况，例如降植烷造模法，需要6个月左右的造模时长；MRL/Lpr小鼠至少也需要10周龄以上，才会出现神经精神症状；二、上述造模方法部分伴随着其它非狼疮脑病症状，例如降植烷造模法常常会伴随肠道炎症等；三、由于狼疮脑病往往是系统性红斑狼疮重症的并发症，狼疮症状也会逐渐加重，例如降植烷造模小鼠和MRL/Lpr小鼠的死亡率往往很高，导致实验开展困难。
[0005]因此，一种理想的狼疮脑病动物模型的构建方法对于狼疮脑病机制研究意义重大。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决现有技术问题，提供一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法。本专利技术提供的狼疮脑病小鼠模型的构建方法，能够在短时间内完成狼疮脑病的诱导，操作方便，模型构建精准且存活率高。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008]一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，所述方法是通过向小鼠脑内注射MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4
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T细胞诱导正常小鼠狼疮脑病的发生，构建小鼠狼疮脑病模型。
[0009]本专利技术中所述正常小鼠为不具有狼疮脑病及其相关生理特征的小鼠。
[0010]优选的，所述正常小鼠为C57BL/6小鼠、MRL/MPJ小鼠或BALB/c nude小鼠，更优选为雌雄不限、6
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8周龄的C57BL/6小鼠；更优选的所述的MRL/Lpr狼疮小鼠为雌性、不低于20周龄的小鼠。所述技术方案中的正常小鼠均能够通过本专利技术所述方法实现狼疮脑病小鼠模型的构建，且未发现其他不良反应。
[0011]优选的，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4
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T细胞配置成浓度为50000cells/μl的细胞悬液进行注射，更优选的注射量为5μl，更优选溶剂为PBS。
[0012]更优选的，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4
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T细胞采用磁珠分选技术得到；更优选的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4
+
T细胞分选包括如下步骤：
[0013](1)取材：MRL/Lpr(均为20周，雌性)狼疮小鼠麻醉后断颈处死，取出新鲜脾脏组织；更优选采用1％戊巴比妥钠麻醉；
[0014](2)研磨：将脾脏至于70μm筛网中，加入2ml RPMI 1640培养液，研磨脾脏，收集所有脾脏细胞至15ml离心管中，2000rpm离心5min；
[0015](3)裂红：加入2ml红细胞裂解液充分混匀裂红5min，加入2ml RPMI 1640培养液终止裂解；
[0016](4)计数：用细胞计数仪进行细胞计数，2000rpm离心5min；
[0017](5)分选：每107细胞加入40μl Running Buffer和10μl抗体生物素混合物，充分混匀后4℃孵育5min，每107细胞再次加入30μl Running Buffer和20μl抗生物素微珠，充分混匀4℃孵育10min，每108细胞加入500μl Running Buffer，细胞悬液离心10min，在磁珠分选器上经LS分选柱分选出目标的CD4
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T细胞。
[0018]优选的，脑室内注射CD4
+
T细胞进行造模的具体操作为：腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉C57BL/6小鼠(雌雄不限，6
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8周)，麻醉后根据C57BL/6小鼠脑图谱定位侧脑室，将前囟Bergma点定义为原点，坐标相对bregma：内外侧(X)＝+1/
‑
1mm，前后端(Y)＝
‑
0.5mm，背腹侧(Z)＝
‑
2.30mm；CD4
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T细胞以50000cells/μl重悬在PBS中，将5μl细胞悬液(2.5
×
105cells)在5min内以1μl/min的速度缓慢注射至小鼠大脑侧脑室，留针5min；注射完成后将小鼠置于恒温箱中直至复苏；注射次数为1次。
[0019]优选的，所述诱导为注射后小鼠于常规饲养环境下进行饲养，诱导时间更优选为7天；更优选的，所有动物饲养环境为SPF级，环境温度控制为22
±
1℃，环境湿度控制在50％
‑
55％，12h明暗循环自动转换。动物随机分笼饲养，自由摄水摄食。所有的动物实验均遵照国家试验动物饲养和使用指南以及浙江中医药大学动物实验中心的动物伦理学条例，实验中尽可能地减少动物的使用数量和痛苦。
[0020]优选的，运用新位置识别和强迫游泳行为学作为判断造模成功与否的标准；更优选的，具体为：
[0021](1)新位置识别：在40cm
×
40cm
×
40cm的开阔场地中圈出3个5cm
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5cm的正方形区域(A、B和C)，在A和B区域放置2个相同物块，物块放置于同一水平线上，将小鼠放入场地中自主探索10min，后取出放回笼子，将场地中1个物块移动至斜对角(C区域)，30min后再次将小鼠放入，使用Any
‑
Maze追踪记录3min内自发活动并导出小鼠探索A和C区域的时间数据进行统计分析；
[0022](2)强迫游泳：使用圆形玻璃容器(直径19cm，高26cm)，水深15cm，水温维持在23
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25℃，两个圆形玻璃容器之间用隔板隔开防止小鼠之间相互影响。将小鼠放入容器中使用Any
‑
Maze记录6min；统计小鼠的不动总时间并进行分析。
[0023]一种上述小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。
[0024]一种上述小鼠模型的构建方法构建获得的小鼠模型在筛选预防或治疗狼疮脑病药物中的应用。
[0025]一种筛选预防或治疗狼疮脑病候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
[0026](1)将测试候选药物施用于上述构建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述方法是通过向小鼠脑内注射MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4
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T细胞诱导正常小鼠狼疮脑病的发生，构建小鼠狼疮脑病模型。2.根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述正常小鼠为C57BL/6小鼠、MRL/MPJ小鼠或BALB/c nude小鼠，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠为雌性、不低于20周龄的小鼠。3.根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4
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T细胞配置成浓度为50000cells/μl的细胞悬液进行注射，注射量为5μl。4.根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4
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T细胞采用磁珠分选技术得到。5.根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述脑内注射的具体操作为：正常小鼠麻醉后根据小鼠脑图谱定位侧脑室，将前囟Bergma点定义为原点，坐标相对bregma：内外侧(X)＝+1/
‑
1mm，前后端(Y)＝...

【专利技术属性】
技术研发人员：许正浩，王珂儿，温成平，奚安然，侯晓晓，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：