基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法技术

本发明专利技术属于纳米材料在环境监测应用领域，公开了基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法，所述荧光免疫方法包括：使用左旋谷氨酸为前驱体，超声水热法一步制备带有氨基的碳量子点；使用还原氧化石墨烯方法制备石墨烯片，并通过修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵优化石墨烯，得到能与带有氨基的碳量子点发生良好荧光共振能量转移的石墨烯片；制备的带有氨基的碳量子点与单克隆抗体偶联。本发明专利技术利用一步水热法直接制备了携带氨基的碳量子点，此量子点可以直接与单克隆抗体偶联；本发明专利技术涉及的碳量子点避免了氨基化步骤，线性范围可达0.1ng/mL

【技术实现步骤摘要】
基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法


[0001]本专利技术属于纳米材料在环境监测应用领域，尤其涉及一种基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白(Vitellogenin，Vtg)浓度的荧光免疫方法。

技术介绍

[0002]随着现代工农业的快速发展，环境雌激素如杀虫剂、塑料、多氯联苯、双酚等已被广泛地应用。这些化学物质进入江河湖海以及土壤，导致环境污染。环境雌激素可在体内表现出累积效应，通过干扰内分泌、免疫、神经等系统的正常功能，造成内分泌紊乱、代谢失常和生殖系统损伤等多种疾病，对动物和人类具有不可估量的危害。水体中动物受环境雌激素影响尤为明显，其暴露出的毒理学效应已成为一个全球性的环境问题。世界经济合作与发展组织已经推荐水生脊椎或无脊椎的卵黄原蛋白(Vtg)作为雌激素干扰的生物标志物之一。具有高灵敏度、高特异性、宽探测范围、低探测极限且测试速度快的传感检测方法对环境雌激素的检测具有重要意义。检测卵黄原蛋白浓度可以反应水体的好坏、健康与否。
[0003]由于抗原与抗体之间的免疫反应具有高特异性，因而免疫传感器具有固有的特异性。对于基于单克隆抗体的免疫传感器，一定的抗体能在许多物质中识别特定的抗原，这样基于单克隆抗体的免疫传感技术成为复杂环境监测的发展方向。
[0004]传统的免疫技术包括酶联免疫、辐射免疫法、Westernblots等，近年来又发展了电化学免疫传感器、光学传感方法、免疫胶体金技术等。传统的免疫技术显示高特异性和灵敏度，但存在一些缺点，如酶联免疫方法必须使用酶，而酶的制备及保存对环境条件要求较高；辐射免疫法需要使用具有放射性的元素，可能对环境或人造成伤害；免疫Westernblots方法需要使用二抗。这些方法总体耗时多不适合短时间内大规模检测。近年来，电化学及光学传感器被用于卵黄原蛋白浓度检测。基于阻抗谱的电化学免疫传感器显示宽的测量范围(1000
‑
8000ng/mL)，但灵敏度较低(420ng/mL)；基于电流的电化学免疫传感器呈现低的检测限(0.09ng/mL)但线性范围小(0.25
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7.8ng/mL)；光波导光谱传感器显示宽的测量范围(100
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10000ng/mL)和低的检测限(0.1ng/mL)；表面增强拉曼散射技术检测限很低(5pg/mL)，但线性范围很窄(约0.2ng/mL)。免疫胶体金技术需要使用纳金，而金是一种贵金属，造价高。
[0005]基于石墨烯量子点(GQDs)与还原石墨烯氧化物(RGO)的荧光共振能量免疫荧光传感器检测卵黄原蛋白(Vtg)首先需要将石墨烯量子点氨基化，然后才能与抗体有效偶联。
[0006]为解决上述技术问题，本申请前期进行相关技术开发，提出一种用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法，其主要步骤包括：石墨烯量子点的氨基化；石墨烯量子点与单克隆抗体偶联；还原氧化石墨烯获得水溶性石墨烯以及卵黄原蛋白浓度检测等，其取得的积极效果为灵敏度高，重复性好，抗干扰性强。
[0007]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0008](1)现有技术涉及的石墨烯量子点不能避免氨基化步骤，氨基化耗费时间与能量，增加材料制备成本而且现有技术不能进一步节约时间。现有技术中，将50mL 1mg/mLGQDs水
溶液与50mL的25％的氨水溶液混合，室温搅拌均匀混合。将溶液转移到聚四氟乙烯容器中，在200℃条件下加热10小时，室温冷却。将该溶液进一步加热至95℃一小时，蒸发多余的氨，然后在纯净水中透析纯化24小时，因此现有技术制备成本高而且流程时间长。
[0009](2)现有技术线性探测范围一般在0.001
‑
1500ng/mL，适用性受限。
[0010](3)现有技术1.5μg/ml鸡蛋白和牛血清蛋白荧光恢复率为23.70％和20.51％。

技术实现思路

[0011]为克服相关技术中存在的问题，本专利技术公开实施例提供了一种基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法。本专利技术克服了现有技术1.5μg/ml鸡蛋白和牛血清蛋白荧光恢复率为23.70％和20.51％的问题；实验证明，本专利技术1μg/ml的鸡蛋白和牛血清蛋白荧光恢复率仅为4.23％和2.86％，证明了本专利技术具有更很好的抗干扰性，这是本专利技术的一创新点。
[0012]所述技术方案如下：一种基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法包括：
[0013]使用左旋谷氨酸为前驱体，超声水热法一步制备带有氨基的碳量子点；
[0014]使用还原氧化石墨烯的方法制备石墨烯片，并通过修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)优化石墨烯，得到能与带有氨基的碳量子点发生荧光共振能量转移的石墨烯片(RGO_PDDA)；
[0015]制备的带有氨基的碳量子点与单克隆抗体偶联，得到纯化的抗体
‑
碳量子点偶联物作为荧光纳米探针后，再用于石墨烯片最佳用量的确定、荧光恢复线性曲线的建立，以及重复性、抗干扰性和精度测量。
[0016]在一个实施例中，所述使用左旋谷氨酸为前驱体，超声水热法一步制备带有氨基的碳量子点包括：
[0017]60mL15％的左旋谷氨酸水溶液250℃超声水热反应4
‑
5小时，冷却至室温，过滤，然后透析，再对样品冷冻干燥，得到粉末样品。
[0018]在一个实施例中，所述使用还原氧化石墨烯方法制备石墨烯片，并通过修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵优化石墨烯，得到能与碳量子点发生良好荧光共振能量转移的石墨烯(RGO_PDDA)，包括以下步骤：
[0019]步骤1)配置氧化石墨烯水溶液，超声分散；在搅拌状态下加入氨水，调节pH值为9，再加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌使聚乙烯吡咯烷酮均匀分散在溶液中，滴加抗坏血酸溶液，在磁力搅拌下水浴加热还原；
[0020]步骤2)将所制得的溶液离心，水洗两次去除残留聚乙烯吡咯烷酮，最后用乙醇离心清洗，将还原氧化石墨烯置恒温箱中干燥，得固体石墨烯粉末(RGO)，该粉末样品能均匀分散到水中；
[0021]步骤3)将制备好的RGO与聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)按质量比1：1配制成悬浊液，充分搅拌，水洗离心三次以去除多余的PDDA；最终在恒温干燥箱中干燥成能与带有氨基的碳量子点发生荧光共振能量转移的石墨烯固体粉末，记为RGO_PDDA。
[0022]在一个实施例中，所述带有氨基的碳量子点与单克隆抗体偶联包括以下步骤：
[0023](1)配制2
‑
吗啉乙磺酸(MES)溶液，然后分别取1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基丙基)碳酰二亚
胺(EDC)试剂和N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到MES溶液中，混合搅拌，形成交联剂(EDC
‑
NHS)溶液待用；
[0024](2)取抗体，在其中加入EDC
‑
NHS溶液，搅拌，活化抗体；将活化后的抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法，其特征在于，所述基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法包括：使用左旋谷氨酸为前驱体，通过超声水热法制备带有氨基的碳量子点；使用还原氧化石墨烯方法制备石墨烯片，并通过修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵优化石墨烯，得到能与带有氨基的碳量子点发生荧光共振能量转移的石墨烯片；将制备的带有氨基的碳量子点与单克隆抗体偶联，得到纯化的抗体
‑
碳量子点偶联物作为荧光纳米探针，用于石墨烯片用量的确定、荧光恢复线性曲线的建立，以及重复性、抗干扰性和精度测量。2.根据权利要求1所述的基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法，其特征在于，所述使用左旋谷氨酸为前驱体，通过超声水热法制备带有氨基的碳量子点包括：将60mL15％的左旋谷氨酸水溶液250℃超声水热反应4
‑
5小时，冷却至室温，过滤，然后透析，再对样品冷冻干燥，得到粉末样品。3.根据权利要求1所述的基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法，其特征在于，使用还原氧化石墨烯方法制备石墨烯片，并通过修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵优化石墨烯，得到能与带有氨基的碳量子点发生荧光共振能量转移的石墨烯片，包括以下步骤：步骤1)配置氧化石墨烯水溶液，超声分散；在搅拌状态下加入氨水，调节pH值为9，再加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌使聚乙烯吡咯烷酮均匀分散在溶液中，滴加抗坏血酸溶液，在磁力搅拌下水浴加热还原；步骤2)将所制得的溶液离心，水洗两次去除残留聚乙烯吡咯烷酮，最后用乙醇离心清洗，将还原氧化石墨烯置恒温箱中干燥，得固体石墨烯粉末，该粉末样品能均匀分散到水中；步骤3)将制备好的石墨烯片与聚二烯丙基二甲基氯化铵按质量比1：1配制成悬浊液，充分搅拌，水洗离心三次以去除多余的聚二烯丙基二甲基氯化铵；最终在恒温干燥箱中干燥成能与碳量子点发生荧光共振能量转移的石墨烯固体粉末。4.根据权利要求1所述的基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法，其特征在于，所述带有氨基的碳量子点与单克隆抗体偶联包括以下步骤：(1)配制2
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吗啉乙磺酸溶液，然后分别取1
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乙基
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(3
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二甲基丙基)碳酰二亚胺试剂和N
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羟基琥珀酰亚胺加入到制得的2
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吗啉乙磺酸溶液中，混合搅拌，形成交联剂溶液待用；(2)取抗体，加入交联剂溶液，搅拌，活化抗体；将活化后的抗体和碳量子点的磷酸缓冲盐溶液等体积混合，培育，形成抗体
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碳量子点偶联物；(3)得到纯化的抗体
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碳量子点偶联物作为荧光纳米探针。5.根据权利要求4所述的基于碳量子点的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨爱玲，祁冲，王怀栋，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：