用于多阶段引物延伸反应的方法和组合物技术

描述了用于多阶段引物延伸反应例如多重聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶PCR的方法和组合物。引物延伸阶段是在各阶段之间不打开密闭容器的情况下在所述密闭容器中执行的。所述多阶段引物延伸方法和组合物在早期阶段中利用早期阶段引物并且在后期阶段中利用后期阶段引物，其中所述后期阶段引物在所述早期阶段期间被封闭而不延伸。本技术的封闭引物包含光可切割的封闭基团并且基本上是无活性的，直到封闭基团通过暴露于紫外光而被切割。所述封闭引物可以在不打开所述容器的情况下通过紫外光激活。光激活。光激活。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多阶段引物延伸反应的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年3月26日提交的美国临时申请号62/994,989的权益，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入。


[0003]本公开涉及用于多阶段引物延伸反应的方法和组合物，所述多阶段引物延伸反应为例如多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,PCR)和逆转录酶
‑
PCR。

技术介绍

[0004]聚合酶链式反应(PCR)是一种用于DNA序列的特异扩增方法。PCR是用于下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)文库制备的DNA靶扩增的有用且广泛应用的方法。具体地，引物与核酸混合物中的其靶序列杂交并延伸，之后是附加轮次的引物杂交和延伸。PCR能够指数扩增引物之间的序列，从而使PCR成为非常敏感的技术。然而，PCR可导致不希望的扩增产物。第一，如果引物结合除了它们的靶标以外的其它序列，则脱靶扩增可降低靶序列的产量。第二，PCR引物的浓度必须比靶序列高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在密闭容器中执行多阶段引物延伸反应的方法，所述方法包括：a)在容器中制备引物延伸混合物，其中所述混合物包含：i)多核苷酸靶标；ii)能够进行引物延伸的早期阶段引物；iii)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端处包含光可切割的封闭基团；iv)引物延伸酶；以及v)引物延伸试剂，其中在制备所述混合物后封闭所述容器；b)用所述早期阶段引物执行早期阶段引物延伸反应以产生靶扩增子或靶cDNA；c)将所述后期阶段引物解封闭以产生解封闭的后期阶段引物，其中所述解封闭步骤是在不打开所述容器的情况下执行的；以及d)用所述解封闭的后期阶段引物和所述靶扩增子或靶cDNA执行后期阶段引物延伸反应，其中所述解封闭的后期阶段引物与所述靶扩增子或靶cDNA杂交并延伸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述早期阶段引物包括含有5'区和3'区的靶特异性引物，其中所述3'区包含靶特异性序列，并且所述5'区包含通用序列。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述后期阶段引物包含通用引物，所述通用引物包含所述通用序列或其部分。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述早期阶段引物包括逆转录酶(RT)引物。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述后期阶段引物包括靶特异性引物。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述解封闭步骤(c)包括将所述密闭容器中的所述后期阶段引物暴露于紫外光。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭的引物是根据式I的化合物：
其中：R1是H或OH；碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或它们的经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物；可切割的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性质的基团；任选的接头是二价基团；任选的报告分子是能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分；并且引物是能够与多核苷酸靶标形成双链体的寡核苷酸。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述可切割的终止部分是根据下式的部分或它们的盐、互变异构体或旋光异构体：其中：R3是烷基(C≤8)或经取代的烷基(C1
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8)；R4是氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；R5和R6各自独立地为：氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、烯基(C≤6)、炔基(C≤6)、芳基(C≤6)、芳烷基(C≤8)、杂芳基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；下式的基团：X是
‑
O
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、
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S
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、或
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NH
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；或烷二基(C≤12)、烯二基(C≤12)、炔二基(C≤12)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；Y是
‑
O
‑
、
‑
NH
‑
、烷二基(C≤12)或经取代的烷二基(C≤12)；n是0
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6的整数；并且m是0
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6的整数；或者接头
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报告分子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述可切割的终止部分包括2
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硝基苄基取代基。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述引物选自长度介于8个核苷酸至100个核苷酸之间的寡核苷酸。11.根据权利要求7所述的方法，其中所述碱基选自由以下项组成的组：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、它们的经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物，以及它们的混合物。12.一种用于执行多阶段引物延伸反应的组合物，所述组合物包含：a)多核苷酸靶标，b)能够进行引物延伸的早期阶段引物；c)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端处包含光可切割的封闭基团，并且其中所述组合物在制备所述组合物时封闭的容器...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金春，于尔根，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：