一种基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法及其应用，所述含量检测方法包括：(1)将生物标志物标准品溶液、偶联配体的纳米颗粒溶液和稀释液混合反应，得到标准品复合物溶液；将待测样品、偶联配体的纳米颗粒溶液和稀释液混合反应，得到待测样品复合物溶液；(2)采用微流控芯片宝石孔计数池检测步骤(1)所述标准品复合物溶液和所述待测样品复合物溶液，得到复合物脉冲信号，将所述复合物脉冲信号转化成复合物脉冲数积分，构建生物标志物标准品的复合物脉冲数积分与浓度的标准曲线，通过标准曲线计算所述待测样品中生物标志物的含量。本发明专利技术所述检测方法灵敏度高且操作简单快速，可得到样品中生物标志物的绝对浓度。度。度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物分子检测
，具体涉及一种基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]生物标志物是一种对生理状态、病理过程以及使用药物后的机体反应进行客观判断的标志物。生物标志物的检测作为一种临床医学的辅助手段可以有效辅助判断疾病的发生原因，并可对疾病发展方向和后续治疗手段的选择提供指导。
[0003]生物标志物包括核酸类和蛋白质类，上述两者均为大分子生物标志物。核酸类生物标志物主要指的是体内的核糖核酸(RNA)标志物。RNA存在于血液、体液和组织中，RNA还存在于部分病毒和类病毒的遗传信息载体中。RNA生物标志物主要包括编码蛋白的mRNA和非编码蛋白的microRNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)及血浆游离RNA(cfRNA)等。RNA生物标志物种类多，蕴含的生物信息量丰富，相比DNA更能动态反映细胞生物学功能和调控过程。因此，RNA生物标志物的定量检测和表达分析对于细胞功能研究、疾病的诊断和治疗及预后监测等具有重要意义。
[0004]蛋白质是生物学功能的执行者，位于中心法则的功能一端，能够为基础医学、转化医学和精准医学提供最直接的判定依据，因而是研究和应用最为广泛的标志物。蛋白生物标志物可以帮助人们了解生物学过程，能运用于疾病的高危评估、早期诊断、检测定位、预后判断和治疗反应以及复发监测全过程。因此开发蛋白标志物的检测技术也具有十分重要的意义。/>[0005]目前，RNA生物标志物的体外检测方法主要包括逆转录聚合酶链反应(RT
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PCR)、恒温指数扩增、微阵列技术和RNA测序等；蛋白类生物标志物的检测主要包括酶联免疫吸附试验(Enzyme
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Linked Immunosorbent Assays，ELISA)、化学发光法、电化学分析、表面等离子共振法和表面增强拉曼光谱等。为了实现更低丰度的RNA和蛋白质的检测，近几年出现了数字化的检测方法，如数字PCR和数字ELISA，可用于单个RNA和蛋白质分子的绝对定量检测。但是，目前无论是RNA类还是蛋白质类的检测方法，均具有操作复杂，检测时间长，需要配备专业操作人员及配套昂贵的信号读取仪器等缺点，不适用于偏远落后地区的基层卫生医疗机构使用。
[0006]现场快速检验(Point
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of
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care testing，POCT)由中国医学装备协会POCT装备技术专业委员会在多次专家论证基础上统一命名，并将其定义为：在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。因此，POCT具有操作简便快速，不需要配备专业人员及昂贵复杂的仪器设备等优点，更加适用于偏远落后地区的基层卫生医疗机构使用。侧向层析检测技术是POCT的一种主要形式，该技术可用于蛋白和核酸的快速检测，但是其检测灵敏度较低，难以用于低丰度生物标志物的检测。因此，有必要研发一种新型的高灵敏度的POCT诊断技术，从而实现低丰度蛋白和核酸标志物的检测。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法及其应用。库尔特阻抗法的原理是指悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间阻抗发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数，与颗粒的大小和数目成正比。本专利技术中所述含量检测方法通过将与生物标志物对应的配体包被在纳米级别的不导电颗粒上，形成配体复合物，在检测前将待测生物标志物与配体复合物混合反应，使生物标志物和配体复合物的体积增大，从而提高库尔特阻抗法检测的灵敏度，使用微流控芯片宝石孔计数池检测生物标志物和配体复合物的脉冲信号，实现对生物标志物的定量检测。
[0008]本专利技术所述含量检测方法可实现对生物标志物的高灵敏度检测，且操作简单快速，标准曲线拟合度高，检测准确度高、重复性好，可得到样品中生物标志物的绝对浓度，更加适用于偏远落后地区的基层卫生医疗机构使用，具有重要的应用前景。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法，所述生物标志物含量检测方法包括如下步骤：
[0011](1)将生物标志物标准品溶液、偶联配体的纳米颗粒溶液和稀释液混合反应，得到标准品复合物溶液；将待测样品、偶联配体的纳米颗粒溶液和稀释液混合反应，得到待测样品复合物溶液；
[0012](2)采用微流控芯片宝石孔计数池检测步骤(1)所述标准品复合物溶液和所述待测样品复合物溶液，得到复合物脉冲信号，将所述复合物脉冲信号转化成复合物脉冲数积分，构建生物标志物标准品的复合物脉冲数积分与浓度的标准曲线，通过标准曲线计算所述待测样品中生物标志物的含量；
[0013]所述生物标志物标准品包括蛋白质或核酸。
[0014]库尔特阻抗法的原理被认为是一种细胞计数金标准的技术，库尔特阻抗法提供了一种对微小颗粒大小(体积)进行测量的方法。因其属于对颗粒个体的测量和对颗粒三维的测量，不但能准确测量颗粒的粒径分布，更能用于颗粒绝对数目和浓度的测量。
[0015]在蛋白和核酸类生物标志检测的过程中，单纯的抗原抗体交联或核酸杂交形成的复合物的数量和大小十分有限，难以使用库尔特阻抗法进行检测。因此，通过将待测蛋白(抗原)对应的抗体包被在纳米级别的不导电颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，从而可以利用库尔特阻抗法进行测量；同理，可以将与RNA序列互补的单链核酸包被在纳米至微米级别的不导电颗粒上，使核酸杂交形成的复合物的体积增大，从而可提高库尔特阻抗法检测的敏感性。
[0016]本专利技术中，所述生物标志物含量检测方法是利用库尔特阻抗法对蛋白质和RNA实现超敏检测，实验结果分析平台依托于深圳创怀医疗的POCT微流控血液细胞分析仪CX
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2000系列(技术专利公开号：CN205826667U；CN205826668U)，上述设备配套的微流控芯片宝石孔计数池为一次性可抛耗材，可作为颗粒计数传感元件使用，从而实现快速、精准和低成本的蛋白质和RNA即时检测。
[0017]本专利技术中所述基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法的原理如下：以抗体标记的乳胶微球检测抗原为例。假设一个抗原对应产生一个抗原抗体免疫复合物，那么反
应体系中只存在2种粒径的颗粒，即抗体标记的乳胶微球和乳胶微球抗原抗体免疫复合物，图1、图2和图3为抗体标记的乳胶微球流过宝石孔产生的脉冲信号和直方图示意图，图4、图5和图6为乳胶微球抗原抗体免疫复合物流过宝石孔产生的脉冲信号和直方图示意图，图7、图8和图9为抗体标记的乳胶微球以及乳胶微球抗原抗体免疫复合物流过宝石孔时产生的脉冲信号和直方图示意图。当抗体标记的乳胶微球或乳胶微球抗原抗体免疫复合物在不同时间点分别流过宝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法，其特征在于，所述生物标志物含量检测方法包括如下步骤：(1)将生物标志物标准品溶液、偶联配体的纳米颗粒溶液和稀释液混合反应，得到标准品复合物溶液；将待测样品、偶联配体的纳米颗粒溶液和稀释液混合反应，得到待测样品复合物溶液；(2)采用微流控芯片宝石孔计数池检测步骤(1)所述标准品复合物溶液和所述待测样品复合物溶液，得到复合物脉冲信号，将所述复合物脉冲信号转化成复合物脉冲数积分，构建生物标志物标准品的复合物脉冲数积分与浓度的标准曲线，通过标准曲线计算所述待测样品中生物标志物的含量；所述生物标志物标准品包括蛋白质或核酸。2.根据权利要求1所述的基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物标志物标准品为蛋白质，所述生物标志物标准品溶液的浓度范围为0.057
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321.24mg/L；优选地，步骤(1)中，所述生物标志物标准品为核酸，所述生物标志物标准品溶液的浓度范围为0.2
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1000copies/μL。3.根据权利要求1或2所述的基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述纳米颗粒包括乳胶微球、聚苯乙烯微球或磁珠中任意一种；优选地，所述乳胶微球包括羧基乳胶微球；优选地，步骤(1)中，所述纳米颗粒的粒径为50
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5000nm；优选地，步骤(1)中，所述稀释液包括PBS缓冲液和/或水。4.根据权利要求1
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3任一项所述的基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述偶联配体的纳米颗粒溶液是由包括如下步骤的制备方法制得的：采用1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基琥珀酰亚胺对纳米颗粒进行活化，将配体与活化后的纳米颗粒混合，得到混合液，进行一次振荡反应，得到一次反应液，将所述一次反应液与乙醇胺混合，进行二次振荡反应，得到二次反应液，离心收集沉淀，用缓冲液重悬沉淀得到偶联配体的纳米颗粒溶液。5.根据权利要求4所述的基于库尔特阻抗法的生物标志物含量检测方法，其特征在于，所述配体包括抗体或单链核酸；优选地，所述单链核酸包括氨基修饰的单链核酸；优选地，所述配体为抗体，混合液中所述抗体与所述活化后的纳米颗粒的质量比为5
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100μg抗体/mg纳米颗粒；优选地，所述配体为氨基修饰的单链核酸，所述混合液中所述氨基修饰的单链核酸与所述活化后的纳米颗粒的浓度质量比为100
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1000pmol单链核酸/mg纳米颗粒；优选地，所述一次反应液与乙醇胺混合后，所述乙醇胺的终浓度为1
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100mM；优选地，所述一次振荡反应的转速为5000
‑
12000rpm，所述一次振荡反应的时间为1.5
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2.5h；优选地，所述二次振荡反应的转速为5000
‑
12000rpm，所述二次振荡反应的时间为25
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35min；
优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛晨晨，庄斌，
申请(专利权)人：深圳创怀医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：