一种痰液化试剂及其结核分枝杆菌集菌镜检方法技术

本发明专利技术公开了一种痰液化试剂及其结核分枝杆菌集菌镜检方法，本方法将化学处理方法与物理温度湿热处理方法相结合最大程度减少了化学液化处理法对结核分枝杆菌菌体结构的破坏，通过物理温度湿热处理又起到了充分液化和灭活结核分枝杆菌的目的，降低了生物安全风险；使用磷酸盐缓冲液，中和液化试剂对结核分枝杆菌的作用，加强了菌体的着色效果；采用粘附性强的黏附载玻片代替普通玻片，痰膜不易脱落；因化学处理强度的减弱，部分细胞及杂菌成分的残留物存于蓝色背景中，与红色的结核分枝杆菌形成鲜明对比，阅片人员易轻松定位视野，更佳容易发现结核分枝杆菌；且相较于单纯的化学液化处理法，结核分枝杆菌不易褪色，涂片标本的保留价值更高。本的保留价值更高。本的保留价值更高。

【技术实现步骤摘要】
一种痰液化试剂及其结核分枝杆菌集菌镜检方法


[0001]本专利技术属于医学检测
，涉及一种结核分枝杆菌液化试剂及其集菌镜检方法。

技术介绍

[0002]痰涂片抗酸染色镜检是诊断结核分枝杆菌病最常用的实验室方法，该方法依据分枝杆菌细胞膜含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，分枝菌酸具有抗酸性，染料将分枝杆菌染色后，分枝杆菌细胞膜能抵抗乙醇等脱色剂作用，使分枝杆菌能保持染料的颜色。分枝杆菌抗酸性是菌体内的分枝菌酸、RNA蛋白及其细菌壁的完整性相结合的综合反应，即抗酸性的强弱除与细胞壁的完整性有关以外，还与其细菌成熟和衰老程度有关。该方法因操作简便，成本低廉而被广泛应用于基层医疗机构。然而，痰标本直接涂片抗酸染色阳性率较低，且存在生物安全风险。直接涂片抗酸染色显微镜检查结核分枝杆菌菌量需达到5000～10000条菌/毫升样本才能被检出，所以直接涂片抗酸染色阳性率常低于20％，大量涂片阴性患者不易被发现，其传染性不可忽视，在结核病传播方面存在极大隐患。所以提高结核分枝杆菌涂片镜检的各种集菌技术应用而生。对痰等呼吸道标本的集菌首先要建立在对痰标本的充分液化基础上，且对于结核分枝杆菌来说还要保证操作人员和实验环境的生物安全。目前通过纯化学试剂对痰标本液化并对结核分枝杆菌进行灭活处理的方法，杂菌及细胞成分的被充分消化分解，结核分枝杆菌菌体菌体结构也受到一定程度的破坏，对抗酸性存在或多或少的影响，必然影响结核分枝杆菌富集后的镜检效果。如何兼顾消化细胞与杂菌、富集结核分枝杆菌并减少化学试剂对结核分枝杆菌菌体结构的影响是各类化学液化试剂研发的重点。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是在于克服现有技术的不足，提供一种新的痰液化试剂和痰液化处理方法，减轻单纯的化学液化灭活处理法对结核分枝杆菌菌体结构的破环，最大程度的提高结核分枝杆菌抗酸染色涂片镜检阳性率。
[0004]本专利技术的技术方案是:
[0005]一种痰液化试剂，每100mL水溶液中含有NaOH 1.5～4g、柠檬酸三钠1.5～4g、N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸0.5～1.5g。
[0006]所述的水溶液为纯净水或去离子水。
[0007]一种结核分枝杆菌集菌镜检方法：
[0008]1)收集呼吸道痰液标本；
[0009]2)将痰液标本与上述的痰液化试剂以1:1～2的体积加入到离心管中；
[0010]3)将离心管置水浴箱中湿热处理，使痰液标本充分液化，结核分枝杆菌被灭活；
[0011]4)在离心管中加入缓冲液，离心，富集结核分枝杆菌；
[0012]5)倾倒干净上清液，沉淀物混匀，吸取沉淀物涂片至玻片上，烤干；
[0013]6)制好的玻片加入石碳酸复红染液，加热热染；
[0014]7)流水冲洗石碳酸复红染液；
[0015]8)盐酸酒精脱色；
[0016]9)用亚甲基蓝复染，待玻片干燥后镜检。
[0017]所述的缓冲液为磷酸盐溶液。
[0018]所述的磷酸盐溶液PH为6～7，摩尔浓度为0.06～0.07mol/L。
[0019]所述湿热处理温度为75～80℃，作用时间为20min。
[0020]所述的离心管为50ml的一次性尖底离心管。
[0021]所述玻片为黏附载玻片。
[0022]本专利技术有如下技术效果：本方法将化学处理方法与物理温度湿热处理方法相结合最大程度减少了化学液化处理法对结核分枝杆菌菌体结构的破坏，通过物理温度湿热处理又起到了充分液化和灭活结核分枝杆菌的目的，降低了生物安全风险；使用磷酸盐缓冲液，中和液化试剂对结核分枝杆菌的作用，加强了菌体的着色效果；采用粘附性强的黏附载玻片代替普通玻片，痰膜不易脱落；因化学处理强度的减弱，部分细胞及杂菌成分的残留物存于蓝色背景中，与红色的结核分枝杆菌形成鲜明对比，阅片人员易轻松定位视野，更容易发现结核分枝杆菌；且相较于单纯的化学液化处理法，结核分枝杆菌不易褪色，涂片标本的保留价值更高。对于菌量较少的标本，本方法阳性检出的可能性比直接涂片和单纯化学处理(液基夹层杯法)高得多。
附图说明
[0023]图1是直接涂片抗酸染色图。
[0024]图2本实验方法抗酸染色结果图。
[0025]图3液基夹层杯法抗酸染色结果图(单纯的化学处理法)。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例将对本专利技术作进一步地详细描述。
[0027]实施例1
[0028]本专利技术实施例提供了一种痰液化试剂及其结核分枝杆菌集菌镜检方法，包括以下步骤：
[0029]1)收集呼吸道痰液标本；
[0030]2)将痰液标本与痰液化试剂按照1:1～2的比例加入到50ml的尖底离心管中痰液中，所述痰液化试剂每100mL去离子水溶剂含有1.5～4gNaOH、1.5～4g柠檬酸三钠、0.5
‑
1.5gN
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸，目的：痰液化试剂中NaOH的作用，液化细胞及杂菌，结核分枝杆菌因对使用浓度的NaOH能耐受，而不被消化；柠檬酸三钠辅助液化痰标本；N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸的加入能使痰标本的液化更佳彻底。
[0031]3)将加好痰液与消化液的离心管至于75～80℃水浴箱中湿热处理20分钟。75～80℃水域箱中湿热处理20分钟目的，标本在湿热的情况下充分液化，并保证结核分枝杆菌在75～80℃作用20分钟能充分被灭活。
[0032]4)温浴完的标本加入磷酸盐溶液(PBS)缓冲液至45ml，然后4000转离心10分钟。加
PBS缓冲液的目的，中和NaOH的碱性使NaOH不再持续对结核分枝杆菌起作用，保证抗酸染色时使结核分枝杆菌着色效果更佳。离心的目的，富集结核分枝杆菌。
[0033]5)倾倒干净上清液，沉淀物混匀，用一次性吸管吸取沉淀物涂片至粘附玻片上，涂片宽度大约1.5*1.5cm大小，然后将湿玻片至于干片机上烤干，干片机温度控制在50℃左右。使用粘附载玻片的目的：标本染色过程中不易脱膜。
[0034]6)制好的玻片直接加入石碳酸复红染液，直到标本被染液浸泡覆盖，酒精灯加热热染5分钟。热染目的：保证结核分枝杆菌着色效果；玻片加石炭酸复红之前不再火焰固定。
[0035]7)流水冲洗石碳酸复红染液。
[0036]8)加适量的盐酸酒精脱色1分钟后流水冲洗，如脱色不干净可以重复操作。
[0037]9)加亚甲基蓝复染，染色30秒后流水冲洗干净，待玻片自然干燥后镜检。
[0038]10)低倍镜下找到视野后转油镜下观察，分枝杆菌染成红色，背景染成蓝色。
[0039]如图1所示，细胞、杂菌及粘液丝都清晰存在，被染成蓝色，形成蓝色背景。因菌量极少，直接涂片抗酸染色油镜下观察300个视野未发现抗酸阳性分枝杆菌，结果报告：抗酸杆菌阴性(...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种痰液化试剂，其特征在于：每100mL水溶液中含有NaOH 1.5～4g、柠檬酸三钠1.5～4g、N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸0.5～1.5g。2.根据权利要求1所述的一种痰液化试剂，其特征在于：所述的水溶液为纯净水或去离子水。3.一种结核分枝杆菌集菌镜检方法：1)收集呼吸道痰液标本；2)将痰液标本与权利要求1所述的痰液化试剂按照1:1～2的体积加入到离心管中；3)将离心管置水浴箱中湿热处理，使痰液标本充分液化，结核分枝杆菌被灭活；4)湿热处理完后加入缓冲液，离心，富集结核分枝杆菌；5)倾倒干净上清液，沉淀物混匀，吸取沉淀物涂片至玻片上，烤干；6)制好的玻片加石碳酸复...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹红，
申请(专利权)人：邹红，
类型：发明
国别省市：