本发明专利技术涉及动物病毒学技术领域，尤其涉及一种快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法，试剂盒包括iiPCR扩增液，所述iiPCR扩增液包括引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针、第三引物对和第三探针、第四引物对和第四探针、第五引物对和第五探针。本发明专利技术针对临床中猪的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等病理组织样品，经核酸提取，直接将DNA或者RNA作为模板，即可完成iiPCR检测。即可完成iiPCR检测。
【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法
[0001]本专利技术涉及动物病毒学
，尤其涉及一种快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒及其使用方法。
技术介绍
[0002]近年来，我国生猪产业集约化的养殖新模式渐成趋势，规模化猪场养殖密度的增加使得猪群之间的接触频率显著升高，这也间接地加快了疾病(特别是病毒性疾病)的传播速度，许多猪类疫病混合感染的比例大幅度上升，并且多种病原体共感染可引起相似且典型的临床症状(通称为“症候群”)。其中，猪繁殖障碍性疾病，又称为“猪繁殖障碍症候群”，就是一大类以妊娠母猪发生流产、产死胎、木乃伊胎、产弱仔、母猪不孕、公猪不育为主要特征表现的疾病。目前，猪繁殖障碍性疾病在我国养猪场中普遍存在，严重危害着国内养猪业的健康发展。虽然，不同的病原所造成的猪繁殖障碍的临床症状可能存在一定的差异，但是由于临床中经常会出现多种病原或者一种病原的不同基因型、血清型混合感染的现象，而且很难通过大体剖检对致病原进行确诊，因此针对同一症候群下的不同病原进行精准地鉴别诊断是非常必要的。当前，以猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)所引起的猪群主要垂直传播性疾病为主要危害。
[0003]猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)是一种单股正链RNA病毒，可分为欧洲型(基因I型)和美洲型(基因II型)两种基因型。虽然，欧洲型PRRSV在我国某些省份有被检出过，但是绝大多数毒株都呈现出偶发或者散发的特征。1996年，中国首次报道了美洲型PRRSV的出现，随后在国内各主要养猪地区均存在该类病毒的流行。2006年以来，我国相继出现了高致病性的PRRSV毒株、类NADC30 毒株、类NADC34毒株、RFLP 1
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4Lineage 1C毒株等优势变异株。PRRSV 具有复杂的遗传多样性，病毒基因组中的ORF5和Nsp2是两个较为高变的区域。基于ORF5基因的系统发生树分析法将美洲型PRRSV分为Lineage 1～ 9分支谱系，在中国主要流行的是Lineage 1(代表毒株：类NADC30、类 NADC34)、Lineage 3(代表毒株QYYZ、GM2)、Lineage 5(代表毒株VR2332)、 Lineage 8(代表毒株CH
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1a)、Lineage 9(代表毒株：XJNJ)等谱系毒株。此外，我国疫苗毒株与流行毒株以及流行毒株之间常发生重组事件，致使田间毒株生物学特性复杂多变。
[0004]猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)是一种线性双链DNA病毒， PRV只有一个血清型，但不同毒株之间毒力有所差异。20世纪60年代以后，随着PRV强毒株的出现，猪伪狂犬病在世界范围内频繁暴发，我国为了控制 PRV的流行，1979年从匈牙利进口了Bartha
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K61疫苗，该疫苗在国内得到了广泛的应用，并且取得了良好的防控效果，猪群新生仔猪的发病率和死亡率均低于10％。但是自2011年以后，我国PRV免疫失败的案例层出不
穷，具体表现为接种了Bartha
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k61弱毒疫苗的猪群再次出现感染，并且其发病率和死亡率呈现明显上升趋势。对当前PRV流行毒株分子特征的分析结果表明，流行株的gB、gC、gD和gE基因已经出现了一定程度的遗传变异，这使得变异株与经典毒株处于不同的进化分支上，经典毒株属于基因1型，变异株多为基因2型。
[0005]古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是一种单股、正链RNA 病毒。通过序列比对分析可将全球范围内的CSFV分离毒株分为3种基因型 (1型、2型和3型)和11个基因亚型(1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、 3.1、3.2、3.3和3.4亚型)，而2.1亚型又可以进一步划分为2.1a～2.1j十个亚群。自20世纪90年代起，中国的CSFV分离毒株主要包括1.1、2.1、2.2 和2.3四种基因亚型。当前，2.1亚型毒株在我国流行最为广泛，其中2.1b 亚群已经成为主要流行的优势毒株，2.1c亚群主要在我国南方地区流行。1.1、 2.2和2.3亚型毒株呈现出地方性散发的特征。
[0006]猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种单股、线性、无囊膜的DNA 病毒。自20世纪80年代起，中国上海、北京、江苏等地陆续分离到猪细小病毒，当前PPV呈现出全国性散发、零星流行。根据毒株VP蛋白的遗传多样性，猪细小病毒至少可分为7种基因型，包括PPV1、PPV2、PPV3、PPV4、 PPV5、PPV6和PPV7，通常用于区分猪细小病毒亚科成员。其中，PPV1是从污染的细胞中分离获得的经典基因型毒株，而PPV2～PPV6毒株则是通过宏基因组测序等检测技术被发现的。这7个基因型PPV根据NS1蛋白序列同源性在细小病毒系统发育树上又被划分为Protoparvovirus(PPV1)、 Tetraparvovirus(PPV2和PPV3)、Copiparvovirus(PPV4、PPV5和PPV6) 和Chaphamaparvovirus(PPV7)四个不同的属。截至目前，中国国内发现的本土毒株涵盖了全部的七种基因型。其中，PPV2和PPV3是主要流行的基因型，其次是PPV1和PPV7，PPV 4、PPV5和PPV6分离率相对较低。针对 PPV的免疫防控，我国PPV商品化疫苗均为全病毒灭活苗，但是不同地区所选择的毒株之间存在一定的差异，这些毒株通常包括PPV CP
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99、S
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1、BJ
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2、 WH
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1、NJ、CG
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05、YBF01、L等。
[0007]日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种单股、正链、有囊膜的RNA病毒，它能够引起一种急性、自然疫源性蚊媒传播的人兽共患传染病——“日本脑炎”。JEV感染谱较广，自然情况下，鸟类、蝙蝠、马、牛、人等均可感染。对人而言，大部分感染者呈隐性感染，但少数患者会出现严重的脑炎症状，表现为神经麻痹、痉挛性瘫痪、小脑共济失调。此外，猪是JEV重要的储存宿主和增殖宿主，也是日本脑炎的主要传染源。JEV仅有1种血清型，基于c/prM、E基因的核苷酸序列，可将其分为5种基因型 (GI型～GV型)。其中，基因I、II、III型是其主要基因型，IV型和V本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒，包括iiPCR扩增液，其特征在于，所述iiPCR扩增液包括引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针、第三引物对和第三探针、第四引物对和第四探针、第五引物对和第五探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的PRRSV上游引物和如SEQ ID NO.2所示的PRRSV下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的PRRSV探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的PRV上游引物和如SEQ ID NO.5所示的PRV下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6所示的PRV探针，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.7所示的CSFV上游引物和如SEQ ID NO.8所示的CSFV下游引物，所述第三探针包括如SEQ ID NO.9所示的CSFV探针，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.10所示的JEV上游引物和如SEQ ID NO.11所示的JEV下游引物，所述第四探针包括如SEQ ID NO.12所示的JEV探针，所述第五引物对包括如SEQ ID NO.13所示的PPV2上游引物和如SEQ ID NO.14所示的PPV2下游引物，所述第五探针包括如SEQ ID NO.15所示的PPV2探针。2.根据权利要求1所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。3.根据权利要求2所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为进行灭活处理过的PRRSV、PRV、CSFV、JEV、PPV2病毒液，接毒剂量为1
×
106TCID
50
/mL；所述阴性对照为Nuclease
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free水。4.根据权利要求1所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括待测样品，所述待测样品类型为猪的病理组织。5.根据权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，余良政，侯闻闻，朱振邦，刘盼娆，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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