H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用。具体涉及H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备和安全性和免疫效力的评估。本发明专利技术所述H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗安全有效，可以在SPF鸡体内诱发强烈的体液免疫以及细胞免疫应答，作为一种新型疫苗在应对H9N2禽流感疫情时有良好的前景。有良好的前景。有良好的前景。

【技术实现步骤摘要】
H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒 mRNA疫苗及制备方法与应用。

技术介绍

[0002]流感病毒为多节段单股负链有囊膜的RNA病毒，流感病毒可根据核蛋白和基质蛋白的抗原性差异分为A，B，C三种型，H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒，病毒粒子由核衣壳和病毒囊膜构成。在亚洲的禽类中广泛传播，病理表现为轻微的呼吸道症状，引发继发感染后会感染导致死亡。
[0003]A型流感病毒基因组按照基因长度由PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和NS这8个负链和单链RNA片段组成，每种病毒基因至少编码一种蛋白。 HA是一种三聚体形式的吸附蛋白，C端末端的一个疏水区插入病毒囊膜中，是血凝素蛋白与病毒囊膜结合的部位，N端末端的一个疏水区有膜融合活性，与病毒入侵宿主细胞有关，还会诱导中和抗体产生和细胞免疫，是病毒表面的主要抗原之一。而灭活疫苗主要诱导体液免疫，细胞免疫较弱，随着H9N2病毒的不断变异，在各个国家都出现了疫苗接种失效的情况。
[0004]mRNA疫苗是一种将RNA在体外进行相关的修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋白抗原，从而导致机体产生针对该抗原的免疫应答，进而扩大机体的免疫能力的疫苗。与全细菌、亚单位和DNA疫苗等其他疫苗相比，mRNA 疫苗可以诱导T细胞和B细胞免疫反应，并且是非整合性和可自然降解的，因此，不存在感染或插入诱变的风险。其次，通过体外转录反应可以快速、廉价地合成mRNA，因此很容易可以在短时间内大量生产。第三，病毒载体疫苗成本高，对机体免疫影响大，LNP比之相对安全，出现自身免疫反应几率小。对于机体来说，机体所产生的抗原存在时间长，数量多，它的特异性免疫记忆和免疫应答就越强、越快。mRNA疫苗从接种、被递送到目标靶点、呈递抗原直至降解，整个过程中疫苗接种量不会对抗原数量产生较大影响，且mRNA所呈递的抗原存在时间长，不会迅速被消化，十分有利于免疫应答。
[0005]总体来说，mRNA疫苗具有研发周期短，生产工艺简单，易于批量生产；研发周期短，能够快速开发新型候选疫苗；安全性好，不需要佐剂，不含病毒成分，无感染风险；具有双重免疫机制，免疫原性强等优势，所以mRNA疫苗正成为对抗感染性疾病的强大平台。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA 疫苗及制备方法与应用。
[0007]本专利技术的目的是提供一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，包括：
[0008]以H9N2亚型禽流感病毒HA全长为模板，经过PCR扩增得到扩增产物；扩增产物连接入pVAX1质粒，构建了pVAX1
‑
HA重组质粒；
[0009]反向PCR线性化重组质粒，带有T7启动子的线性化质粒在T7 RNA聚合酶作用下体
外转录后得到目的片段mRNA；
[0010]通过牛痘病毒加帽系统和Poly(A)聚合酶进行mRNA修饰，得到mRNA 疫苗。
[0011]其中，通过牛痘病毒加帽系统和Poly(A)聚合酶进行mRNA修饰具体包括：
[0012]mRNA纯化：将所述体外转录后得到的mRNA进行氯化锂、乙醇沉淀纯化；
[0013]mRNA加帽：在加帽酶催化下，在mRNA的5
’
端加上帽子结构，得到带有帽子结构的mRNA；
[0014]mRNA纯化：将所述加帽后的mRNA进行氯化锂、乙醇沉淀纯化；
[0015]mRNA加尾：在Poly(A)聚合酶催化下，ATP以AMP的形式添加到 mRNA 3
′
端，即在mRNA的3
′
端加20
‑
200个A碱基，得到加帽和加Poly(A) 尾的mRNA；
[0016]mRNA纯化：将所述加尾后的mRNA进行氯化锂、乙醇沉淀纯化。
[0017]优选的，上述H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，PCR扩增所用引物为：
[0018]上游引物H9N2 HA p1：
[0019]5’‑ꢀ
GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCATGGAAGTAGCATCACTAATAACTATACT
‑ꢀ3’
；
[0020]下游引物H9N2 HA p2：
[0021]5’‑ꢀ
TCCGAGCTCGGTACCAAGCTTTTATATACAAATGTTGCATCTGCAAGC
‑3’
。
[0022]优选的，上述H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，pVAX1质粒以及重组质粒酶切位点均是NheI、HindIII；
[0023]反向PCR得到线性化质粒的引物序列如下：
[0024]pVAX1
‑
HAp1：5
’‑
TTATATACAAATGTTGCATCTGCAAGA
‑3’
；
[0025]pVAX1
‑
HA p2：5
’‑
ATGGAAGTAGCATCACTAATAACTATACTACTAG
‑ꢀ3’
。
[0026]优选的，上述H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，将纳米脂质体与修饰后的mRNA自组装后制备成粒子形态的mRNA疫苗。
[0027]本专利技术还提供了一种由上述方法制备的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗。
[0028]本专利技术还提供了一种针对H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的抗原，所述抗原是HA原核蛋白，其抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0029]本专利技术还提供了一种用于制备针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗的 mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0030]本专利技术还提供了一种与所述的mRNA互补的DNA，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
[0031]本专利技术还提供了一种包含所述的mRNA的载体。
[0032]本专利技术还提供了一种所述的mRNA在制备针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗中的应用。
[0033]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0034]典型H9N2亚型禽流感病毒颗粒呈球状，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白 (M2)，中间为基质蛋白(M1)，内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为 10nm。在病毒感染过程中，HA为三聚体结构，可以识别并结合细胞膜表面唾液酸(SA)受体，和使病毒囊膜与内吞体膜融合，在病毒吸附细胞和穿膜过程中起重要作用。HA的前体是HA0，经蛋白酶裂解后变成HA1和HA2两条链，产生N端融合肽，促进病毒囊膜与内吞体膜融合。HA受体结合区(RBD)位于三聚体顶端的球形结构域，与宿主
细胞表面SA结合。
[0035]本专利技术先通过分子生物学方法得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括：以H9N2亚型禽流感病毒HA全长为模板，经过PCR扩增得到扩增产物；扩增产物连接入pVAX1质粒，构建了pVAX1
‑
HA重组质粒；反向PCR线性化重组质粒，带有T7启动子的线性化质粒在T7 RNA聚合酶作用下体外转录后得到目的片段mRNA；通过牛痘病毒加帽系统和Poly(A)聚合酶进行mRNA修饰，得到mRNA疫苗。2.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，PCR扩增所用引物为：上游引物H9N2 HA p1：5
’‑
GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCATGGAAGTAGCATCACTAATAACTATACT
‑3’
；下游引物H9N2 HA p2：5
’‑
TCCGAGCTCGGTACCAAGCTTTTATATACAAATGTTGCATCTGCAAGC
‑3’
。3.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，pVAX1质粒以及重组质粒酶切位点均是NheⅠ、HindⅢ；反向PCR得到线性化质粒的引物序列如下：pVA...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮文科，张博文，徐胜奎，姚劼林，夏婷，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：