一种复合交联酶聚集体催化剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种复合交联酶聚集体催化剂及其制备方法与应用，具体为一种α

【技术实现步骤摘要】
一种复合交联酶聚集体催化剂及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种复合交联酶聚集体催化剂及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]阿可拉定，又名淫羊藿素，来自天然植物淫羊藿，是一种典型的异戊烯丙基黄酮苷类化合物。研究表明，阿可拉定具有抗肿瘤、抗风湿、抗抑郁、改善心脏分化等多种药理作用，尤其在治疗晚期肝癌上活性突出，被誉为继青蒿素之后中药的又一重大突破。阿可拉定软胶囊作为新型肝癌治疗药物已完成Ⅲ期临床实验并于2022年1月获批上市，因此阿可拉定的高效制备意义重大。
[0003]目前，阿可拉定的制备方法主要有三种：直接提取法、化学合成法以及糖基去除法。由于在草本植物淫羊藿中的天然含量不足0.1%，直接提取分离阿可拉定步骤复杂，难以大量生产。化学合成制备阿可拉定所需催化剂昂贵、条件苛刻且副产物多，不符合绿色生产理念。如图1所示，朝藿定A/B/C、淫羊藿苷等在内的黄酮苷化合物是淫羊藿中的主要活性成分，3位碳与7位碳上糖基的不同导致活性差异不同。其中阿可拉定是不含糖基、极性最小、活性最高的苷元，故可由其他黄酮苷的去糖基化制备获得。传统酸碱法去糖基环境污染较大，基于糖苷酶的生物酶解法因反应条件温和、环境污染小等优势具有广阔的应用前景。
[0004]朝藿定C在淫羊藿中含量丰富，丰度高于其他黄酮苷，通过对其7位碳的一个葡萄糖基与3位碳的两个鼠李糖基进行酶解来制备阿可拉定极具工业价值。Xie等（XIE J, ZHANG S, TONG X, et al. Process Biochemistry, 2020, 93: 115
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24）2020年首次利用α
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L
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鼠李糖苷酶粗酶液与β
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D
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葡萄糖苷酶两步法催化朝藿定 C合成了阿可拉定。但此方法酶解朝藿定C制备阿可拉定涉及双酶催化，两步反应存在反应时间长、中间产物累积的问题。此外，游离酶形式的催化剂存在催化效率低、稳定性差、难以重复使用的缺点。尤其是游离糖苷酶的耐糖性普遍偏差，无法实现高底物浓度下的催化，从而严重限制了阿可拉定的工业化生产。
[0005]酶的固定化技术可克服游离酶催化效率低、难以重复使用、缺乏稳定性等不足。交联酶聚集体（CLEAs）作为一种无载体固定方法，与传统的载体固定化酶相比，具有催化剂比表面积大、酶活回收高、操作简单、成本低等明显优点。然而，一种利用基于交联酶聚集体的共固定化酶解决酶催化效率低、糖耐受差等问题以实现阿可拉定高效生物合成的合理策略尚未得到开发。

技术实现思路

[0006]针对以上问题，本专利技术的主要目的在于提供一种复合交联酶聚集体（combi
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CLEAs）作为共固定双酶催化剂，用于实现阿可拉定的高效生物合成，填补多酶共固定化酶制备阿可拉定的空白（图2）。本专利技术同时提供一种通用的复合交联酶聚集体combi
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CLEAs制备方法，用于提高蛋白酶的催化性能，尤其用于改善糖苷酶的糖耐受性。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种复合交联酶聚集体催化剂，为α
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L
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鼠李糖苷酶与β
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D
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葡萄糖苷酶的共固定化酶，为200
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300 nm的球状颗粒构成的网状或簇状结构，在1220
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1330 cm
‑1范围内有红外吸收峰。
[0008]所述复合交联酶聚集体催化剂的制备方法，包括以下步骤：1）将α
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L
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鼠李糖苷酶粗酶液与β
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D
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葡萄糖苷酶粗酶液混合获得粗酶混合液；其中β
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D
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葡萄糖苷酶和α
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L
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鼠李糖苷酶的酶活比为1:1~1:4；2）在所述粗酶混合液中加入沉淀剂进行共沉淀反应；所述沉淀剂为饱和硫酸铵溶液、乙醇、异丙醇、丙酮中的一种或几种，粗酶混合液与沉淀剂的体积比为1:0.1~1:1；共沉淀反应条件为4~25
ꢀ°
C下孵育2~24 h；3）将共沉淀反应后的体系加入交联剂进行共交联反应；所述交联剂为戊二醛、京尼平、聚乙烯亚胺中的一种或几种；交联剂的体积占粗酶混合液体积的0.1%~0.5%，共交联反应条件为4~25
ꢀ°
C下孵育2~24 h；4）共交联后反应体系离心、洗涤获得所述复合交联酶聚集体催化剂，共交联反应条件为4
ꢀ°
C，孵育2 h。
[0009]进一步的优化，步骤1）中β
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D
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葡萄糖苷酶和α
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L
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鼠李糖苷酶的酶活比为1:2。步骤1）中所述α
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L
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鼠李糖苷酶与β
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D
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葡萄糖苷酶来源于篮状菌Talaromyces stollii CLY
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6，粗酶液由毕赤酵母表达获得。
[0010]进一步的优化，步骤2）所述沉淀剂为饱和硫酸铵溶液，粗酶混合液与沉淀剂的体积比为1:1，共沉淀反应条件为4
ꢀ°
C，孵育3 h。
[0011]进一步的优化，步骤3）所述交联剂为戊二醛；交联剂的体积占粗酶混合液体积的0.2%。
[0012]进一步的优化，步骤4）离心条件为转速6000~120000 rpm下离心5~30 min。
[0013]所述的复合交联酶聚集体催化剂在阿可拉定生物合成中的应用。用于催化朝藿定C一锅法制备阿可拉定，包括以下步骤：将所述复合交联酶聚集体催化剂与0.5~150 mg/mL朝藿定C混合进行催化反应，催化反应条件为在pH 3.0~8.0（优选pH5.0），30~80 ℃，（200~800 rpm）孵育1~8h。催化反应结束后通过离心、洗涤对所述复合交联酶聚集体催化剂进行回收，回收后的复合交联酶聚集体催化剂用于新一轮的催化。通过离心、洗涤对所述复合交联酶聚集体催化剂进行回收离心条件为转速6000~120000 rpm下离心5~30 min。
[0014]根据本专利技术的实施方案，制备的复合交联酶聚集体催化剂催化活性为游离酶的100%~170%，糖耐受性较游离酶相比提高5~20倍。
[0015]根据本专利技术的实施方案，制备的复合交联酶聚集体催化剂可重复使用，具体为重复使用10次后活性保留初始活性的60%以上。
[0016]根据本专利技术的一个实施方案，制备的复合交联酶聚集体催化剂催化100 mg/mL朝藿定C在8 h内生成34.24 mg/mL的阿可拉定，转化率达77.45%。
[0017]根据本专利技术的实施方案，复合交联酶聚集体的制备方法包括共沉淀和共交联两个过程，二者均存在有利于糖苷酶活性与稳定性提高的改变，其中共沉淀过程作用更大。
[0018]本专利技术的有益效果：（1）本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复合交联酶聚集体催化剂，其特征在于，为α
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鼠李糖苷酶与β
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D
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葡萄糖苷酶的共固定化酶，为200
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300 nm的球状颗粒构成的网状或簇状结构，在1220
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1330 cm
‑1范围内有红外吸收峰。2.一种复合交联酶聚集体催化剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将α
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鼠李糖苷酶粗酶液与β
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葡萄糖苷酶粗酶液混合获得粗酶混合液；其中β
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葡萄糖苷酶和α
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L
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鼠李糖苷酶的酶活比为1:1~1:4；2）在所述粗酶混合液中加入沉淀剂进行共沉淀反应；所述沉淀剂为饱和硫酸铵溶液、乙醇、异丙醇、丙酮中的一种或几种，粗酶混合液与沉淀剂的体积比为1:0.1~1:1；共沉淀反应条件为4~25
ꢀ°
C下孵育2~24 h；3）将共沉淀反应后的体系加入交联剂进行共交联反应；所述交联剂为戊二醛、京尼平、聚乙烯亚胺中的一种或几种；交联剂的体积占粗酶混合液体积的0.1%~0.5%，共交联反应条件为4~25
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C下孵育2~24 h；4）共交联后反应体系离心、洗涤获得所述复合交联酶聚集体催化剂。3.根据权利要求2所述的复合交联酶聚集体催化剂的制备方法，其特征在于：步骤1）中β

【专利技术属性】
技术研发人员：梁浩，刘芳，赵雨轩，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：