抽核缓冲液、缓冲液组合、制备方法和应用技术

本申请公开了抽核缓冲液、缓冲液组合、制备方法和应用，用于抽提烟草幼嫩组织单细胞核测序样本，以便对其进行snRNA

【技术实现步骤摘要】
抽核缓冲液、缓冲液组合、制备方法和应用


[0001]本申请涉及植物单细胞核RNA测序
，具体涉及一种抽核缓冲液、缓冲液组合、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]单细胞测序作为最新的前沿热点技术，在人、动物细胞中广泛应用，但是在植物生物学研究领域的应用相对较少。高等动植物是由不同形态和功能的多细胞组成的生命体，而不同形态细胞基因表达模式差异化导致了生物多样性。为了精准揭示复杂的生命活动，因此需要借助单细胞RNA测序技术(single
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cell RNA sequencing,scRNA
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seq)研究动植物发育过程中不同细胞类型的作用及其分子调控规律。 ScRNA
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seq在研究细胞间基因表达异质性、分析细胞拟时轨迹和鉴定稀有细胞类型等方面具有重要意义。然而，相较于动物单细胞RNA 测序研究，植物存在细胞壁结构导致了单细胞样品制备相对困难，例如，单细胞或原生质体制备过程中需要优化不同植物组织中除去细胞壁的酶、存在酶解诱导应激基因表达、原生质体可变性和活性波动大等因素，这些因素阻碍单细胞测序技术在植物发育生物学研究的进程。
[0003]细胞核是细胞遗传与代谢的调控中心，包括了大量的DNA、RNA 及蛋白分子以维持调节基因组的功能，因此植物单细胞核RNA测序技术(single
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nuclei RNA sequencing,snRNA
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seq)在植物研究逐渐崭露头角。相较于动物细胞核的分离纯化方法已经很稳定，植物细胞由于存在细胞壁、胞间连丝和内含物粘连在一起，这给植物细胞核制备增加了难度。植物细胞核分离纯化需要综合考虑材料选择、预处理、提取液选择、细胞的破碎方法及纯化方法。
[0004]烟草(Nicotiana tabacum L.cv.K326)是我国广泛种植的特种叶用经济作物。在烟叶生产中，烟草“打顶”是提高烟叶品质和产量的重要生产技术之一。打顶后，由于烟株顶端优势丧失，产生大量的腋芽，破坏了营养平衡，导致其品质严重下降。目前，去除腋芽的方法有很多，比如使用化学抑制剂、人工剥除腋芽等，但其实施过程存在污染环境、耗时、成本高等问题。因此，利用生物学手段研发不含腋芽或含少量腋芽的烟草材料对烟叶生产具有重要意义。然而，目前通过提取烟草细胞核进行测序的手段及通过该手段揭示烟草发育的过程尚未报导。

技术实现思路

[0005]本申请专利技术人创造性地公开了抽核缓冲液、缓冲液组合、制备方法和应用，用于抽提烟草幼嫩组织单细胞核测序样本，以便对其进行 snRNA
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seq测序。本申请通过抽核缓冲液及含有该抽核缓冲液组合可以抽提收集烟草组织的单细胞核，然后通过分选细胞核，评估RNA 质量并测序，得到烟草单细胞核测序样本，该方法可以为单细胞测序技术在烟草基因种质资源挖掘或在揭示烟草发育和抗性过程中提供一种新的手段。
[0006]为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
[0007]第一方面，本申请实施例公开了一种抽核缓冲液，所述抽核缓冲液包含：0.5～1.5M DTT，0.3～0.75％Triton
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100，0.5～1.5tablet/50mL 蛋白酶抑制剂，0.3～0.6U/μL RNA酶抑制剂，0.05～0.15mM精胺和 0.3～0.7mM亚精胺的PBS溶液，pH值为6.5～7.5。
[0008]第二方面，本申请实施例公开了一种缓冲液组合，用于制备烟草单细胞核测序样本，所述缓冲液组合包括抽核缓冲液；
[0009]染色缓冲液，用于对所述烟草单细胞核进行染色；
[0010]收集缓冲液，用于对由所述抽核缓冲液中提取的目标进行分选得到烟草单细胞核进行收集。
[0011]第三方面，本申请实施例公开了一种烟草单细胞核测序样本的制备方法，包括如下步骤：
[0012]向新鲜的烟草组织中添加抽核缓冲液WB，快速破碎组织到匀浆状；
[0013]将破碎的组织匀浆在冰上进行裂解，得到的匀浆悬浮液过滤，离心，收集下层沉淀；
[0014]将沉淀重悬于抽核缓冲液WB中，再次过滤，并将滤液收集至 EP管中，冰上静置一段时间后，用染色缓冲液染色；
[0015]分选细胞核，提取RNA，检测RNA浓度和纯度；
[0016]使用收集缓冲液将细胞核浓度调整至400～600个细胞核/μL，并根据10
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Genomics Single cell盒进行封装；
[0017]使用Agilent 2100Bioanalyser质检评估RNA质量并测序，得到烟草单细胞核测序样本。
[0018]第四方面，本申请的实施例公开了第三方面所述的烟草单细胞核测序样本在烟草基因种质资源挖掘或在揭示烟草发育和抗性过程中的应用。
[0019]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
[0020]本申请通过抽核缓冲液及含有该抽核缓冲液组合可以抽提收集烟草组织的单细胞核，然后通过分选细胞核，评估RNA质量并测序，得到烟草单细胞核测序样本，该方法不仅可以为烟草基因种质资源的挖掘提供重要保障，而且也将从单细胞水平揭示更多的烟草发育和抗性过程中的分子调控机制。
附图说明
[0021]图1为本申请实施例提供的烟草单细胞核测序样制备方法的流程示意图。
[0022]图2为本申请实施例烟草顶芽和腋芽组织电镜形态图。
[0023]图3为本申请实施例烟草WB缓冲液中不同PH值抽提细胞核荧光显微镜检测图；
[0024]图4为本申请实施例烟草WB缓冲液添加DTT抽提细胞核荧光显微镜检测图。
[0025]图5为本申请实施例烟草WB缓冲液添加Triton
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100抽提细胞核荧光显微镜检测图。
[0026]图6为本申请实施例烟草单细胞核FACS流式细胞仪DAPI峰分选图。
[0027]图7为本申请实施例烟草单细胞核荧光显微镜镜检图。
[0028]图8为本申请实施例烟草单细胞核样品Countstar Rigel S2系统机检图。
[0029]图9为本申请实施例烟草单细胞核Agilent 2100Bioanalyser质检 RNA质量图。
Inhibitor Cocktail。
[0041]基于此，本申请实施例还公开了一种缓冲液组合，用于制备烟草单细胞核测序样本。该缓冲液组合包括上述实施例提供的抽核缓冲液、用于对所述烟草单细胞核进行染色的染色缓冲液，以及用于利用所述抽核缓冲液中提取的进行目标分选得到烟草单细胞核进行收集的收集缓冲液。该缓冲液组合能够使得对烟草单细胞核提取过程中始终保持完整的状态，不被蛋白酶和RNA酶对单细胞的酶解，最终得到符合snRNA
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seq测序要求的样本。
[0042]在一些实施例中，该染色缓冲液为包含10～15μM DAPI、0.3～0.6 U/μL RNA酶抑制剂的PBS溶液。
[0043本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抽核缓冲液，所述抽核缓冲液包含：0.5～1.5M DTT，0.3～0.75％Triton
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100，0.5～1.5tablet/50mL蛋白酶抑制剂，0.3～0.6U/μL RNA酶抑制剂，0.05～0.15mM精胺和0.3～0.7mM亚精胺的PBS溶液，pH值为6.5～7.5。2.根据权利要求1所述的抽核缓冲液，所述抽核缓冲液包含0.6～1.2M DTT，0.4～0.6％Triton
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100，0.7～1.3tablet/50mL蛋白酶抑制剂，0.4～0.6U/μL RNA酶抑制剂，0.07～0.12mM精胺和0.3～0.65mM亚精胺的PBS溶液，pH值为6.5～7.5；可选地，所述缓冲液包含0.8～1.2M DTT，0.45～0.6％Triton
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100，0.9～1.2tablet/50mL蛋白酶抑制剂，0.4～0.6U/μL RNA酶抑制剂，0.08～0.12mM精胺和0.4～0.6mM亚精胺的PBS溶液，pH值为6.8～7.3；可选地，所述缓冲液包含1.0M DTT，0.5％Triton
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100，1.0tablet/50mL蛋白酶抑制剂，0.5U/μL RNA酶抑制剂，0.1mM精胺和0.5mM亚精胺的PBS溶液，pH值为7.0。3.根据权利要求1或2所述的抽核缓冲液，所述抽核缓冲液采用DEPC
·
H2O作用稀释剂。4.一种缓冲液组合，用于制备烟草单细胞核测序样本，所述缓冲液组合包括权利要求1或2所述的抽核缓冲液；染色缓冲液，用于对所述烟草单细胞核进行染色；收集缓冲液，用于对由所述抽核缓冲液中提取的目标进行分选得到烟草单细胞核进行收集。5.根据权利要求4所述的缓冲液组合，其中，所述染色缓冲液包含10～15μM DAPI、0.3～0.6U/μL RNA酶抑制剂的PBS溶液；可选地，所述染色缓冲液为包含10～13μM DAPI、0.4～0.55U/μL RNA酶抑制剂的PBS溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兵，雷波，王丰，任学良，焦雨铃，田彩环，余婧，赵会纳，余世洲，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：