用于调控基因表达的系统技术方案

描述了与基因表达调控有关的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用核酸构建体调控基因表达的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开认识到替代剪接在用核酸构建体调控核酸构建体中的效用。在一些实施方案中，本公开认识到利用配体结合适体调控基因表达的效用。表达的效用。表达的效用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于调控基因表达的系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年8月30日提交的美国临时申请号62/894,611、2019年9月23日提交的美国临时申请号62/904,635和2020年6月24日提交的美国临时申请号63/043,504的优先权，所述申请各自的内容以引用方式整体并入本文。
[0003]政府许可权
[0004]本专利技术是在由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)颁发的EB013584在政府支持下完成的。政府对本专利技术具有一定的权利。

技术介绍

[0005]可通过提高灵敏度和减少泄漏来改进用于调节基因表达的基于核酸的构建体。

技术实现思路

[0006]本公开认识到与可调控基因产物表达相关的核酸构建体的发现。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用核酸构建体调控基因表达的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开认识到替代剪接在调控核酸构建体中的基因表达中的效用。在一些实施方案中，本公开认识到利用配体结合适体调控基因表达的效用。
[0007]在一些实施方案中，本公开提供了一种用于调节基因表达的系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述polyA适体多核苷酸在5'至3'方向上包含：5'剪接供体位点；工程内含子；第一3'剪接受体位点；polyA开关，其包含具有一个或多个配体结合口袋的两个或更多个配体结合适体，和其中的至少一个polyA切割信号；第二3'剪接受体位点；以及编码可表达多肽的核酸序列。
[0008]在一些实施方案中，本公开的polyA适体多核苷酸包含两个配体结合适体。在一些实施方案中，polyA适体多核苷酸包含三个配体结合适体。在一些实施方案中，polyA适体多核苷酸包含polyA开关，所述polyA开关包含三向接合部(three way junction)。在一些实施方案中，三向接合部包括一个或多个RNA双链茎的接合部。在一些实施方案中，三向接合部的部分是单链的。在一些实施方案中，RNA双链茎包含配体结合适体。在一些实施方案中，编码可表达多肽的核酸序列包含5
’
UTR。
[0009]在一些实施方案中，本公开提供了一种用于调节细胞中基因产物表达的方法。方法包括以下步骤：向细胞中引入系统，所述系统在5'至3'方向上包含：5'剪接供体位点；工程内含子；第一3'剪接受体位点；polyA开关，其包含具有一个或多个配体结合口袋的两个或更多个配体结合适体，和其中的至少一个polyA切割信号；第二3'剪接受体位点。在一些实施方案中，通过本文所述的方法表达的基因产物对于细胞是外源性的。在一些实施方案中，通过本文所述的方法表达的基因产物对于细胞是内源性的。在一些实施方案中，本公开提供的方法发生在个体的一个或多个细胞中，配体是葡萄糖，个体患有糖尿病、糖尿病前期或糖尿病并发症，且/或可表达的多核苷酸是胰岛素。在一些实施方案中，本公开提供的方法发生在个体的一个或多个细胞中，可表达的多核苷酸是治疗性基因产物，诸如人生长激
素、凝血因子X或抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，本公开提供的方法发生在个体的一个或多个细胞中，配体是癌症生物标志物的基因产物，并且可表达的多核苷酸是自杀基因。在一些实施方案中，本公开提供的方法发生在个体中，可表达的多核苷酸是报告基因，并且报告基因的表达位置和/或强度提供关于配体在个体的一个或多个细胞中的空间分布、时间波动或两者的信息。在一些实施方案中，本公开提供的方法发生在个体、组织或细胞中，其中可表达的多核苷酸编码可检测的基因产物，并且其中对相应的个体、组织或细胞进行成像。
附图说明
[0010]图1A至图1C提供了本文所述的polyA适体多核苷酸方面的示意图。图1A描绘了基于配体诱导的替代剪接和polyA信号切割的“混合”开关机制。图1B描绘了Y形polyA开关的配置。对Y形结构的不同部分的名称进行标记。图C示出了具有代表性的Y形polyA开关Y196CAA的配置。
[0011]图2A至图2C展示了另外的Y形结构的结果，所述Y形结构不同地配置并且polyA切割信号不同地定位。polyA信号由红线指示。三向接合部由方框指示。图2A和图2B示出了替代的Y形配置，其中三个适体(适体A、B和C)在三向接合部周围不同地排列。图2C示出了三个相互堆叠的适体而没有三向接合部。
[0012]图3A至图3C展示了本文所述的polyA适体多核苷酸中polyA切割信号数量的修饰结果。图3A示出了位于两个不同茎上的2个polyA信号(红色方框)。图3B仅示出了部分埋在臂1
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2中的一个polyA信号。图3C示出了臂1
‑
2中嵌入2个polyA信号(红色方框)。
[0013]图4A至图4L展示了本文所述的polyA适体多核苷酸的三向接合部的修饰结果。图4L示出了最佳的三向接合部序列。
[0014]图5展示了相对于本文所述的polyA适体多核苷酸的三向接合部的位置的polyA信号的修饰结果。
[0015]图6A至图6B展示了本文所述的polyA适体多核苷酸的第三双链茎(在图1B中称为臂3
‑
1和3
‑
2)的修饰结果。图6A展示了臂3
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1的修饰结果。图6B展示了臂3
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2的修饰结果。
[0016]图7A至图7B展示了本文所述的polyA适体多核苷酸的第二双链茎(在图1B中称为臂2
‑
1和2
‑
2)的修饰结果。图7A展示了臂2
‑
2的修饰结果。图7B展示了臂2
‑
1的修饰结果。
[0017]图8展示了本文所述的polyA适体多核苷酸的第一双链茎(在图1B中称为臂1
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2)上部的修饰结果。
[0018]图9展示了本文所述的polyA适体多核苷酸的第一双链茎(在图1B中称为臂1
‑
1)下部的修饰结果。
[0019]图10A至图10B展示了本文所述的polyA适体多核苷酸的适体方向的修饰结果。图10A示出了在适体B的方向反转的情况下的结果。图10B示出了在适体A的方向反转的情况下的结果。
[0020]图11A至图11B展示了本文所述的polyA适体多核苷酸中每个适体的贡献。图11A示出了通过A到C点突变(由箭头指示)使每个适体失活的作用。图11B示出了删除适体A对诱导作用的影响。
[0021]图12A至图12D展示了在本文所述的polyA适体多核苷酸之后修饰可表达多核苷酸
的5'UTR的结果。图12A示出了使用不同亲本构建体在可表达多核苷酸的5'UTR中插入CAA重复序列(下划线)的结果。图12B示出了使用S56作为亲本构建体测试具有强3'剪接位点的新5'UTR序列的结果。图12C示出了将非结构化间隔区序列插入Y305和Y300的5'UTR的结果。图12D示出了在5'UTR中的3'剪接位点之前插入CAA重复序列。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于调节基因表达的系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述polyA适体多核苷酸在5'至3'方向上包含：a)5'剪接供体位点；b)工程内含子；c)第一3'剪接受体位点；d)polyA开关，其包含具有一个或多个配体结合口袋的两个或更多个配体结合适体，和其中的至少一个polyA切割信号；e)第二3'剪接受体位点；以及f)编码可表达多肽的核酸序列。2.如权利要求1所述的系统，其中所述polyA开关包含两个配体结合适体。3.如权利要求1所述的系统，其中所述polyA开关包含三个配体结合适体。4.如权利要求1所述的系统，其中所述polyA开关包含三向接合部。5.如权利要求4所述的系统，其中所述三向接合部包含第一双链RNA茎、第二双链RNA茎和第三双链RNA茎的接合部。6.如权利要求5所述的系统，其中所述第一双链RNA茎不包含配体结合适体。7.如权利要求5所述的系统，其中所述第一双链RNA茎、第二双链RNA茎和第三双链RNA茎中的每一个都包含配体结合适体。8.如权利要求5所述的系统，其中所述三向接合部包含至少一个单链区。9.如权利要求8所述的系统，其中所述三向接合部包含第一单链区、第二单链区和第三单链区。10.如权利要求9所述的系统，其中所述第一单链区位于所述第一双链RNA茎与所述第二双链RNA茎之间。11.如权利要求9所述的系统，其中所述第二单链区位于所述第二双链RNA茎与所述第三双链RNA茎之间。12.如权利要求9所述的系统，其中所述第三单链区位于所述第一适体的所述第三双链RNA茎与所述第一双链RNA茎之间。13.如前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述第一适体和所述第二适体在5'至3'方向上处于相同方向。14.如前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述第三适体在5'至3'方向上相对于所述第一适体和所述第二适体处于相反方向。15.如权利要求1所述的系统，其中所述polyA切割信号的一个或多个核苷酸在所述三向接合部、所述第三双链RNA茎、所述第三单链区或所述第一双链RNA茎内。16.如权利要求15所述的系统，其中所述第三单链区包含所述polyA切割信号的前四个碱基。17.如权利要求15所述的系统，其中所述第一双链RNA茎包含所述polyA切割信号的最后两个碱基。18.如权利要求15所述的系统，其中所述第一双链RNA茎包含所述polyA切割信号的全部。19.如权利要求3所述的系统，其中所述第三适体的结合口袋与所述三向接合部之间的
双链RNA茎的长度在10与15个碱基对之间。20.如权利要求10所述的系统，其中所述第一单链区包含至少一个选自C和A的碱基。21.如权利要求11所述的系统，其中所述第二单链区包含至少一个选自C和A的碱基。22.如权利要求5所述的系统，其中所述第二双链RNA茎的序列是SEQ ID NO.:3。23.如权利要求5所述的系统，其中所述第三双链RNA茎的序列是SEQ ID NO.:2。24.如权利要求5所述的系统，其中所述第一双链RNA茎的序列是SEQ ID NO.:4。25.如权利要求5所述的系统，其中所述第一双链RNA茎的序列是SEQ ID NO.:5。26.如权利要求1所述的系统，其中所述编码可表达多肽的核酸序列还包含5'UTR。27.如权利要求26所述的系统，其中所述5'UTR还包含CAA重复序列。28.如权利要求26所述的系统，其中所述5'UTR还包含一个或多个3'剪接受体位点。29.如权利要求26所述的系统，其中所述工程化5'UTR具有序列SEQ ID NO.:48。30.如权利要求1所述的系统，其还包含所述编码可表达多肽的核酸序列的5'和所述polyA切割信号的3'的G
‑
U丰富区。31.如权利要求29所述的系统，其中所述3'受体位点之后是调节替代剪接的强度的核酸三联体序列。32.如权利要求31所述的系统，其中所述核酸三联体在相对于所述5'UTR中的所述第二3'受体位点的3'并且具有选自以下的序列：TAG、TCT、TTC、TTG、TGA、TGC、TCC、ACA、AAC、ACC、AGC、AGG、CCT和CCC。33.如权利要求1所述的系统，其还包含所述编码可表达多肽的核酸序列的5'和所述G
‑
U丰富区的3'的G丰富区。34.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：