聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用制造技术

本发明专利技术公开了聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用，属于体外诊断试剂技术领域。所述免疫层析检测试纸条包括结合垫，所述结合垫上包被有聚左旋多巴纳米颗粒

【技术实现步骤摘要】
聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用


[0001]本专利技术涉及体外诊断试剂
，具体涉及聚左旋多巴纳米颗粒作为免疫标记物在制备免疫层析检测试纸条中的应用。

技术介绍

[0002]标记免疫技术的原理是利用荧光素、放射性同位素、酶等标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应检测相应的抗原或抗体。抗原抗体反应的专一性和标记物的放大效应保证了标记免疫技术的特异性和灵敏度。
[0003]免疫层析检测技术(Lateral Flow Immunoassay，LFIA)是20世纪80年代初发展起来的免疫检测技术，其工作原理为：将针对待测抗原的一种特异性抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜(NC)上作为检测区(T区)，另一种特异性抗体与标记物偶联，固定在结合垫上。当待测物样本加到试纸条一端的样本垫上，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的标记物试剂后相互反应，再移动到T区时，待测物与标记物试剂的结合物与T区相应抗体结合而被截留，聚集于T区形成有颜色的条带。
[0004]免疫标记技术中标记物性能是影响检测结果准确性和灵敏度的关键因素。胶体金是免疫层析技术中最常用到的标记物，胶体金是金单质(Au)的水溶胶，胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不破坏其生物活性，可以与蛋白质等非共价结合，形成胶体金标记物。胶体金颗粒可以呈现一定的颜色，因此作为示踪标记物应用于抗原抗体反应。胶体金免疫层析法一般为定性或半定量检测，快速方便，反馈迅速，但是稳定性不足，检测结果灵敏度较差。鉴于此，一些发光材料包括荧光、上转磷光、化学发光材料等以及磁性材料被相继研究开发，大大提升检测灵敏度，但是发光材料类标记物在检测时往往需要精密仪器，操作步骤复杂、耗费时间长，不适用即时检测和现场应用。
[0005]鉴于胶体金免疫层析试纸条操作方便、直观以及反馈迅速的特点，利用胶体金进行标记的检测试纸条仍是目前应用于现场即时检测的主流商品，然而制备胶体金的氯金酸价格昂贵，而且检测试纸条在市场上流通存在重金属污染的问题。
[0006]因此，开发一种能够替代胶体金、制造成本更低且具有优异显色性的标记物应用于免疫层析检测试纸是本领域技术人员需要解决的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种新型纳米颗粒进行抗体或抗原的标记应用到免疫层析检测中，从而降低试纸制造成本，提高试纸检测灵敏度，进一步为试纸的半定量或定量检测提供可能性。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提供了聚左旋多巴纳米颗粒作为标记物在制备免疫层析检测试纸条中的应用。
[0010]进一步的，免疫层析检测试纸条包括结合垫，所述结合垫上包被有聚左旋多巴纳
米颗粒
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抗体/抗原复合物，所述复合物为利用聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基与抗体或抗原偶联制得。
[0011]免疫层析检测试纸条由PVC底板以及粘贴在PVC底板上沿层析方向依次铺设的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫组成，样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在层析膜的一侧，吸水垫部分搭接在层析膜的另一侧。本专利技术将聚左旋多巴纳米颗粒与标记抗体或抗原偶联，包被于结合垫上，提供了一种新型的免疫层析检测试纸条。
[0012]聚左旋多巴纳米颗粒为左旋多巴单体自聚合形成的纳米颗粒，聚左旋多巴纳米颗粒表面存在大量羧基基团，可以与蛋白质共价结合，形成稳定的复合物，同时共价结合不破坏蛋白质生物活性。另外，聚左旋多巴纳米微球聚集产生肉眼可见的黑色，因此，聚左旋多巴纳米颗粒可以作为示踪标记物应用于抗原抗体反应。本专利技术研究表明，大粒径聚左旋纳米颗粒的聚集可以产生高强度的黑色从而显著提升检测灵敏度。
[0013]进一步的，所述聚左旋多巴纳米颗粒
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抗体/抗原复合物的制备方法包括：首先利用1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N
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羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基，然后加入抗体或抗原偶联，再加入封闭液封闭制得所述复合物。
[0014]进一步的，所述聚左旋多巴纳米颗粒的制备方法包括：左旋多巴单体与金属离子络合剂混合后，在70～80℃条件下反应12～24小时制得。
[0015]制备过程中，将左旋多巴单体与金属离子络合剂混合于水中，在金属离子的络合作用下，加速左旋多巴单体的自聚合过程。所述金属离子络合剂包括但不限于镍离子、三价铁离子、镁离子、钙离子或钴离子。
[0016]优选的，反应体系中，左旋多巴单体的浓度为0.5～1mg/mL。
[0017]优选的，所述金属离子络合剂为醋酸镍。
[0018]研究表明，聚左旋多巴纳米颗粒的粒径分布(PDI)以及粒径大小影响到后续的检测性能，在相同的目标物质浓度下，粒径越大的纳米颗粒显色效果越好。优选的，所述聚左旋多巴纳米颗粒的粒径为150～350nm。
[0019]聚左旋多巴纳米颗粒制备过程中，反应体系中金属离子含量越高，所制备的纳米颗粒粒径相对更大。优选的，左旋多巴单体与金属离子络合剂的摩尔比为20～112：1。
[0020]优选的，左旋多巴单体与醋酸镍的摩尔比为25～60：1；反应温度为75℃，反应时间为15小时。
[0021]本专利技术中，与聚左旋多巴纳米颗粒偶联的抗体/抗原为特异性结合待测目标物质的抗体/抗原，可以根据待测目标物质选择相应的抗体或抗原，进而制得用于检测目标物质的免疫层析检测试纸条。
[0022]制备结合垫时，将偶联有特异性抗体/抗原的聚左旋多巴纳米颗粒喷涂于预处理后的结合垫上，干燥后制得结合垫。优选的，结合垫采用奥斯龙8964玻纤。结合垫处理液为磷酸缓冲液、稳定剂和再溶解剂的混合溶液，pH为7～8。
[0023]制备层析膜时，选择对应的抗体、双抗稀释于包被稀释液中，沿层析方向依次平行间隔设置检测线和质控线，干燥后制得层析膜。优选的，层析膜采用硝酸纤维素膜。包被稀释液为磷酸缓冲液、蔗糖的混合溶液，pH为7.4。
[0024]优选的，样品垫采用奥斯龙8964玻纤，样品垫处理液为Tris缓冲液、洗涤剂、封闭剂和防腐剂的混合溶液，pH为7～8。
[0025]具体的，本专利技术提供了一种新型炎症标志物降钙素原(procalcitonin，PCT)检测试纸条，PCT在区分细菌和病毒感染方面具有良好的敏感性，对抗生素治疗监测具有极大的指导价值。在严重感染和脓毒症的辅助诊断中PCT是最好的指标，也可作为脓毒症的一个早期标志物。
[0026]所述PCT检测试纸条包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述结合垫上包被有检测微球，所述检测微球为表面包被有PCT标记抗体的聚左旋多巴纳米颗粒。
[0027]其中，结合垫的制备包括：首先制备聚左旋多巴纳米颗粒，再通过聚左旋多巴纳米颗粒上存在的羧基基团与PCT标记抗体进行偶联得到聚左旋多巴纳米颗粒
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PCT标记抗体复合物，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.聚左旋多巴纳米颗粒作为标记物在制备免疫层析检测试纸条中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，免疫层析检测试纸条包括结合垫，所述结合垫上包被有聚左旋多巴纳米颗粒
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抗体/抗原复合物，所述复合物为利用聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基与抗体或抗原偶联制得。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述聚左旋多巴纳米颗粒
‑
抗体/抗原复合物的制备方法包括：首先利用EDC与NHS活化聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基，然后加入抗体或抗原偶联，再加入封闭液封闭制得所述复合物。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚左旋多巴纳米颗粒的制备方法包括：左旋多巴单体与金属离子络合剂混合后，在70～80℃条件下反应12～24小时制得。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，左旋多巴单体与金属离子络合剂的摩尔比为20～112：1；所述金属离子络合剂为醋酸镍。6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚左旋多巴纳米颗粒的粒径为150～350nm。7.一种新型炎症标志物降钙素原检测试纸条，包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上包被有检测微球，所述检测微球为表面包被有降钙素原标记抗体的聚左旋多巴纳米颗粒。8.如权利要求7所述的新型炎症标志物降钙素原检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备结合垫：首先采用左旋多巴单体与醋酸镍制备聚左旋多巴纳米颗粒，然后利用MES缓冲溶液清洗聚左旋多巴纳米颗粒，并将体系pH调至5.5～6.7，利用EDC与NHS活化微球表面羧基，与PCT标记抗体偶联，再用酪蛋白溶液进行封闭处理制得聚左旋多巴纳米颗粒
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PCT标记抗体复合物；最后将聚左旋多巴纳米颗粒
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PCT标记抗体复合物喷涂于预处理后的结合垫上；(2)制...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐建斌，何康松，叶雅冰，王信，
申请(专利权)人：杭州墨炬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：