一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法，涉及农业科学技术领域，为解决现有的鸡球虫的疫苗大多数只有刺激保护性免疫功能，缺少快速修护球虫感染后造成的肠道菌群失调问题，导致养殖效益低的问题。包括以下步骤：步骤一：准备好制备材料和设备，依次进行质量检测，查看是够可以正常使用，其中培养基需要准备五个；步骤二：进行重组质粒pDGIEF

【技术实现步骤摘要】
一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及农业科学
，具体为一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]巨型艾美耳球虫在所有球虫中的免疫原性最强，接种适宜的卵囊即可让机体对同源球虫产生坚强的免疫力，甚至有部分交叉免疫力。目前已鉴定的巨型艾美耳球虫的免疫保护性抗原有多种，其虫体表面抗原IMP1被证实具有较好的免疫保护原性；
[0003]例如公告号为CN111840530A的中国授权专利(一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VNQS的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法)：包括步骤一，VNQS编码基因的克隆，根据鸡球虫基因序列设计上游引物SEQIDNO:3 和下游引物SEQIDNO:4,进行PCR扩增、电泳得到一条约1500bp的片段，将该产物连接转化后得到序列全长为1452bp的VNQS,其序列为 SEQIDNO:1。
[0004]现有的鸡球虫的疫苗大多数只有刺激保护性免疫功能，缺少快速修护球虫感染后造成的肠道菌群失调问题，导致养殖效益低，为此，我们提供一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的现有的鸡球虫的疫苗大多数只有刺激保护性免疫功能，缺少快速修护球虫感染后造成的肠道菌群失调问题，导致养殖效益低的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一：准备好制备材料和设备，依次进行质量检测，查看是够可以正常使用，其中培养基需要准备五个；
[0008]步骤二：进行重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C的构建；
[0009]步骤三：进行重组枯草芽孢杆菌的构建；
[0010]步骤四：进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，其中需要先进行淀粉酶活性检测，然后进行SDS
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PAGE分析表达产物，再进行western
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blot鉴定表达产物；
[0011]其中，所述步骤一中的培养基包括培养基主体，所述培养基主体的上端设置有培养基盖，所述培养基主体的前后端均设置有限位固定柱，且限位固定柱与培养基主体为一体结构，所述培养基盖的上表面设置有第一进料管，所述第一进料管的一侧设置有第二进料管，且第一进料管和第二进料管与培养基盖均为一体结构，所述第一进料管和第二进料管的一侧均设置有密封塞，所述培养基盖的内壁设置有移动槽，所述移动槽的一端设置有限位槽，且移动槽和限位槽与培养基盖均为一体结构。
[0012]优选的，所述步骤二中重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C的构建需要根据 GenBank上的
EmIMP1C基因序列将EmIMP1C片段插入pDGIEF质粒的Nco I 和Nhe I克隆位点上，将连接产物转化至DH5α，涂板过夜培养，挑取单菌落提取质粒利用其上的酶切位点进行酶切鉴定，经鉴定的阳性菌落进行重组子进行测序验证，将测序成功的菌株在50μg/mL的氯霉素压力下大量培养用以获得重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C。
[0013]优选的，所述EmIMP1C基因序列为FN813227。
[0014]优选的，所述步骤三中重组枯草芽孢杆菌的构建需要将重组质粒 pDGIEF
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EMIMP1C用Sac I酶切线性化后转化入枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞中，涂布于具有SPC抗性的LBG平板上；将在SPC抗性平板上生长的单克隆菌落接种至不含有SPC的LBG液体培养基中于37℃培养24h；取100μL然后涂布于含有1mM IPTG的LB平板上，挑取能够正常生长的单克隆并用PCR验证EMIMP1C基因的存在，阳性克隆命名为SCK6
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EMIMP1C。
[0015]优选的，所述SPC是100μg/mL的壮观霉素，LBG是含1％的葡萄糖的 LB培养基。
[0016]优选的，所述步骤四中的淀粉酶活性检测是通过以下方法鉴定：将 SCK6
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EMIMP1C重组菌与空白对照组SCK用无菌针点种于含有1％淀粉的LB 平板上，在37℃条件下培养12h，用碘液熏蒸后，观察点种的重组菌落周围是否会出现特异的透明圈，如无出现透明环则证明目的基因已整合至 SCK6的a
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淀粉酶基因中：a
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淀粉酶基因上由于同源重组插入了EMIMP1C 片段，破坏了a
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淀粉酶基因的表达，所以没有透明圈的出现。
[0017]优选的，所述步骤四中的SDS
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PAGE分析表达产物是通过以下方法鉴定：将淀粉酶活性检测无透明环的SCK6
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EMIMP1C与空白对照SCK6
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pDGIEF 活化，进行划线，第二天先挑取单菌落接种至LB液体中扩大培养过夜，取2mL菌液于6000g离心10min，并用PBS反复进行洗涤两到三次，然后加入200μLPBS震荡混匀，取样品20μL与5μL上样缓冲液震荡混匀，水浴锅中高温处理10min制备蛋白电泳样本进行SDS
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PAGE电泳，鉴定出表达目标蛋白32Ku的阳性克隆，其中SDS
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PAGE电泳是12.5％的凝胶，将分离胶电泳电压80V，蛋白电泳电压至150V。
[0018]优选的，所述步骤四中的western
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blot鉴定表达产物是通过以下方法鉴定：使用western
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blot对SCK6
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EMIMP1C表达的EMIMP1C蛋白进行进一步鉴定，一抗为EMIMP1C多克隆鸡血清，经鉴定SCK6
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EMIMP1C表达的 EMIMP1C蛋白可与EMIMP1C原核表达刺激产生的抗体进行免疫反应。
[0019]优选的，所述培养基盖的前后表面均设置有抬动圆柱架，且抬动圆柱架与培养基盖为一体结构。
[0020]优选的，所述第一进料管和第二进料管的外壁均设置有密封塞槽，且密封塞槽贯穿第一进料管和第二进料管的管壁，所述第一进料管和第二进料管的内壁均设置有连接槽，且连接槽与密封塞的一端相匹配。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0022]1、本专利技术通过进行重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C的构建、进行重组枯草芽孢杆菌的构建和进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，将巨型艾美耳球虫的免疫保护性抗原EMIMP1蛋白基因通过pDGIEF质粒重组入枯草芽孢杆菌 SCK6基因组，制备鸡球虫EMIMP1C重组枯草芽孢杆菌口服活疫苗，拟实现对巨型艾美耳球虫的免疫保护的同时发挥枯草芽孢杆菌调节肠道菌群、改善鸡生长性能、增强机体免疫力的益生菌作用，使用的枯草芽孢杆菌为可应用于禽类养殖业的益生菌，具备调节肠道本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：准备好制备材料和设备，依次进行质量检测，查看是够可以正常使用，其中培养基需要准备五个；步骤二：进行重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C的构建；步骤三：进行重组枯草芽孢杆菌的构建；步骤四：进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，其中需要先进行淀粉酶活性检测，然后进行SDS
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PAGE分析表达产物，再进行western
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blot鉴定表达产物；其中，所述步骤一中的培养基包括培养基主体(1)，所述培养基主体(1)的上端设置有培养基盖(2)，所述培养基主体(1)的前后端均设置有限位固定柱(7)，且限位固定柱(7)与培养基主体(1)为一体结构，所述培养基盖(2)的上表面设置有第一进料管(3)，所述第一进料管(3)的一侧设置有第二进料管(4)，且第一进料管(3)和第二进料管(4)与培养基盖(2)均为一体结构，所述第一进料管(3)和第二进料管(4)的一侧均设置有密封塞(5)，所述培养基盖(2)的内壁设置有移动槽(8)，所述移动槽(8)的一端设置有限位槽(9)，且移动槽(8)和限位槽(9)与培养基盖(2)均为一体结构。2.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤二中重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C的构建需要根据GenBank上的EmIMP1C基因序列将EmIMP1C片段插入pDGIEF质粒的Nco I和Nhe I克隆位点上，将连接产物转化至DH5α，涂板过夜培养，挑取单菌落提取质粒利用其上的酶切位点进行酶切鉴定，经鉴定的阳性菌落进行重组子进行测序验证，将测序成功的菌株在50μg/mL的氯霉素压力下大量培养用以获得重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C。3.根据权利要求2所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述EmIMP1C基因序列为FN813227。4.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤三中重组枯草芽孢杆菌的构建需要将重组质粒pDGIEF
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EMIMP1C用Sac I酶切线性化后转化入枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞中，涂布于具有SPC抗性的LBG平板上；将在SPC抗性平板上生长的单克隆菌落接种至不含有SPC的LBG液体培养基中于37℃培养24h；取100μL然后涂布于含有1mM IPTG的LB平板上，挑取能够正常生长的单克隆并用PCR验证EMIMP1C基因的存在，阳性克隆命名为SCK6
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EMIMP1C。5.根据权利要求4所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述SPC是100μg/mL的壮观霉素，L...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志坚，殷光文，余春辰，江和基，王磊，王登峰，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：