向导RNA-CAS蛋白复合物的缀合物制造技术

本申请提供了向导RNA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】向导RNA
‑
CAS蛋白复合物的缀合物
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2019年8月19日提交的美国临时申请号62/888,551，于2019年10月14日提交的美国临时申请号62/914,565，和于2019年11月20日提交的美国临时申请号62/937,876的权益。其全部所述专利技术通过引用并入本申请。


[0002]本专利技术涉及一种向导RNA
‑
Cas蛋白质(RNP)复合物缀合物的组合物及其作为药物治疗病毒感染性疾病的用途，以及作为基因调控、插入/剔除和/或校正的治疗方法。缀合物包括向导RNA(s)
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Cas蛋白(RNP)复合物和一个或多个选自一组包含PEG、非PEG聚合物、细胞受体的配体、脂质、寡核苷酸，抗体、多糖和多肽或蛋白的分子。这些分子化学连接到Cas蛋白和/或向导RNA。向导RNA进行了化学修饰，以增加其稳定性，增强目标识别的特异性和最小化/消除毒性。缀合物作为RNP复合物被递送至靶细胞，或在靶细胞中由向导RNA缀合物和编码Cas蛋白的mRNA或质粒或病毒载体生成，或在靶细胞中由crRNA缀合物和编码Cas蛋白和tracrRNA的质粒或病毒载体生成。这些缀合物可用于通过促进模板化DNA修复来提高基因编辑的准确性，通过掩蔽向导RNA
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Cas蛋白复合物的抗原决定位和化学修饰来降低或阻止宿主预先存在的免疫反应，及改善RNP复合物的非病毒递送。

技术介绍

[0003]提供以下对背景的描述只是为了帮助理解本公开内容，而不是承认描述或构成本披露前现有技术。
[0004]CRISPR
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Cas系统是细菌的适应性免疫系统，由成簇的规则间隔的短回文DNA重复序列和CRISPR相关基因组成。CRISPR
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Cas系统保护细菌免受入侵的噬菌体和移动遗传元件的侵害。CRISPR
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Cas9于生物技术和生物医学研究中的众多应用、以及作为基因治疗多种疾病的治疗剂，包括癌症、传染病和遗传病，如镰状细胞性贫血和杜兴氏肌营养不良症(DMD)，正在被开发。在NIH全球数据库中列出的人类细胞中涉及CRISPR的临床试验迄今为止达33项。使用CRISPR
‑
Cas9多重基因编辑，已产生缺乏TCRβ链、B2M、PD
‑
1、TCR和CTLA
‑
4的同种异体通用CAR T细胞，具有增强的效力。CRISPR
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Cas9已被应用于沉默/纠正在阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等神经退行性疾病的致病蛋白，它应该能基本上阻止症状的进一步发展，它也可能是适用于路易体痴呆、额颞叶痴呆、及其它tau蛋白病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)等多种疾病的治疗。催化受损的Cas9(dCas9)可以靶向许多基因组位点，这促成了例如碱基编辑，prime编辑、表观遗传编辑、基因调控以及染色质成像和建模等技术的发展。
[0005]慢性和/或潜伏性病毒感染，例如HIV、HBV和HSV，导致了感染者巨大的痛苦、生命损失和经济负担。这些传染性疾病是不治之症，感染者具有不同程度的传染性，是对公众健康的突出威胁，突显了对治愈性疗法的迫切需求。迄今为止，有效的抗病毒疗法仅抑制病毒复制，但不清除患者体内的病毒，不针对人体细胞中整合的潜在病毒基因(例如前病毒DNA)
或非复制型附加型病毒基因组(例如cccDNA)。然而，据报道，这些病毒DNA直接导致了慢性或潜伏感染。
[0006]多份报告显示CRISPR
‑
Cas9作为靶向病毒基因组的潜在抗病毒药剂，以治疗HBV、HIV、HSV和Epstein
‑
Barr病毒(EBV)等。Yang等人报道了CRISPR/Cas9系统可显著减少在用HBV表达载体转染的Huh
‑
7细胞中HBV核心和表面蛋白的产生，破坏在体外和体内的HBV编码模板，表明其在根除持续性HBV感染方面的潜力。他们观察到两种针对不同位点的组合gRNA可以提高所致插入缺失突变的效率。Seeger和Sohn的研究还报告了CRISPR/Cas9有效灭活通过NTCP编码以允许HBV感染的HepG2细胞中的HBV基因。Wang和Quake观察到来自Burkitt淋巴瘤患者、具有潜伏Epstein
‑
Barr病毒感染的细胞，在暴露于通过质粒递送的靶向病毒基因组的CRISPR/Cas9载体和等摩尔比七种向导RNA的混合物后，停止增长，其病毒滴度同时降低。Hu等人报道的单一和多重配置靶向HIV
‑
1LTR U3区域的CRISPR/Cas9系统可以消除整合的HIV
‑
1基因组。它在潜伏感染的小胶质细胞、前单核细胞和T细胞，完全切除了一个9,709bp的整合前病毒DNA片段，该片段跨越其5
′
到3
′
LTR，并且，对宿主细胞没有造成基因毒性或脱靶编辑。CRISPR
‑
Cas9最近的研究表明，当用于人源化小鼠时，与长效缓释抗逆转录病毒疗法相结合，它可以清除一部分人源化小鼠中的HIV
‑
1，有望治愈这种迄今为止无法治愈的疾病(Dash,et al.Nat.Comm.2019,10,2753)。更多研究可以参见最近的关于CRISPR
‑
Cas9抗病毒应用的综述(Lee,C.Molecules 2019,24,1349)。
[0007]正如先前使用体外或体内转录的crRNA或sgRNA的例子所支持的，在多个位点靶向基因或病毒DNA可以提高有效性。可以通过提供不同化学改性的CRISPR RNA(crRNAs)、单分子向导RNA(sgRNA)或偶联单分子向导RNA(lgRNA)(包括多个靶向基因序列)的混合物/化学库来更好地实施靶向多个位点和/或病毒基因组中单个位点的变异/突变，相当于诸如HAART的联合疗法。

技术实现思路

[0008]本专利技术涉及一种向导RNA
‑
Cas蛋白(RNP)复合物缀合物的组合物及其作为药物在治疗病毒性传染病和基于基因调控、插入/剔除和/或校正疗法的用途。缀合物包含向导RNA(s)
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Cas蛋白(RNP)复合物和一个或多个选自下组包含PEG、非PEG聚合物、细胞受体的配体、脂质、寡核苷酸、抗体、多糖和多肽/蛋白的分子，所述分子化学连接到Cas蛋白和/或向导RNA。缀合物作为RNP复合物递送至靶细胞，或在靶细胞中由向导RNA缀合物和通过共同注射或单独注射递送的编码Cas蛋白的mRNA或质粒或病毒载体生成，或在靶细胞中由crRNA缀合物和共同注射或单独注射质粒或病毒载体在靶细胞中形成的蛋白质和编码Cas蛋白和tracrRNA生成。这些缀合物可用于通过促进模板化DNA修复来提高基因编辑的准确性，通过掩蔽降低向导RNA
‑
Cas蛋白复合物的抗原表位和化学修饰来降低或阻止宿主预先存在的免疫反应，及改善RNP复合物的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种CRISPR
‑
Cas蛋白
‑
向导RNA复合物的缀合物，包括:1)偶联向导RNA
‑
Cas蛋白(RNP)复合物和2)一个或多个分子，选自PEG、非PEG的分子聚合物、细胞受体的配体、脂质、寡核苷酸、抗体、多糖、聚糖和多肽或蛋白，其中所述一个或多个分子与所述RNP复合物以化学方式连接。2.权利要求1的CRISPR
‑
Cas蛋白
‑
向导RNA复合物的所述缀合物，包含与一个或多个选自下组与偶联向导RNA共价连接的分子，包括PEG、非PEG聚合物、细胞受体配体、脂质、寡核苷酸、多糖、聚糖、多肽/蛋白、适配体和/或抗体，以形成偶联向导RNA
‑
缀合物，所述多个分子可以相同也可以不同。3.权利要求1的CRISPR
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Cas蛋白
‑
向导RNA复合物的所述缀合物，包含与一个或多个选自下组与Cas蛋白共价连接的分子，包括PEG、非PEG聚合物、细胞受体配体、脂质、寡核苷酸、多糖、聚糖、多肽/蛋白、适配体和/或抗体形成Cas蛋白
‑
缀合物，所述多个分子可以相同也可以不同。4.权利要求2的所述偶联向导RNA
‑
缀合物，包含不存在、一个或多个选自下组糖部分经过修饰的核苷酸:
其中Q是核碱基，R是H、OH、F、OMe或OCH2CH2OCH3。5.权利要求2的所述偶联向导RNA
‑
缀合物在碱基部分经过化学修饰，所述修饰的碱基选自：
其中：(i)Z是N或CR16；(ii)R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15独立地为H、F、Cl、Br、I、OH、OR'、SH、SR'、SeH、SeR'、NH2、NHR'、NHOH、NHOR'、NR'OR'、NR'2、NHNH2、NR'NH2、NR'NHR'、NHNR'2、NR'NR'2、C1
‑
C6的低级烷基、C1
‑
C6的卤代(F、Cl、Br、I)低级烷基,C2
‑
C6的低级烯基,卤代(F,Cl,Br,I)C2
‑
C6的低级烯基,CN,C2
‑
C6的低级炔基，卤化的(F,Cl,Br,I)C2
‑
C6的低级炔基，C1
‑
C6的低级烷氧基，卤化的(F、Cl、Br、I)C1
‑
C6的低级烷氧基、CN、CO2H、CO2R'、CONH2、CONHR'、CONR'2、CH＝CHCO2H，或CH＝CHCO2R'，其中R'是经过或未经过取代的烷基，其包括,但不限于，H，经过或未经过取代的C1
‑
C20烷基，经过或未经过取代的低级烷基、经过或未经过取代的环烷基、经过或未经过取代的C2
‑
C6炔基、经过或未经过取代的C2
‑
C6低级烯基、经过或未经过取代的芳基、经过或未经过取代的杂芳基、经过或未经过取代的磺酰基或经过或未经过取代的酰基，其包括但不限于C(＝O)烷基，或者，在NR'2的情况下，每个R'包含至少一个C原子，这些C原子连接形成包含至少两个碳的杂环。6.权利要求2的所述偶联向导RNA
‑
缀合物，其靶向区域序列包含选自HIV基因组中的12～20个核苷酸，其中每个胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。7.权利要求2的所述偶联向导RNA
‑
缀合物，其靶向区域序列包含选自HBV基因组中12～20nt，其中每个胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。8.权利要求2的所述偶联向导RNA
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缀合物，其靶向区域序列包含选自HSV基因组中12～20个核苷酸，其中每个胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。
9.权利要求2的所述偶联向导RNA
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缀合物，其靶向区域序列包含选自EBV基因组中12～20nt，其中每个胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。10.权利要求2的所述偶联向导RNA
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缀合物，其靶向区域序列包含选自待编辑的宿主基因组的12～20nt，其中每个胸腺嘧啶被替换为尿嘧啶。11.权利要求2的所述偶联向导RNA
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缀合物，包含一个或多个同位素富集的核苷酸和/或nNt接头，或同位素富集到其全部核苷酸和nNt接头。12.权利要求2的所述偶联向导RNA
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缀合物，包含偶联向导RNA
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和与其缀合的ssDNA模板，所述ssDNA模板包括基因编辑序列和位于基因编辑序列侧翼的、与靶体DNA双链中的目标链或非目标链重叠的两条序列，所述两条序列经过或未经过化学修饰。13.权利要求12所述的基因编辑序列，包括一个或多个终止密码子序列，选自于以下序列组：5'
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【专利技术属性】
技术研发人员：钟明宏，
申请(专利权)人：钟明宏，
类型：发明
国别省市：