一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法技术

本发明专利技术属于猕猴桃雌雄株鉴别方法技术领域，具体为一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法，取猕猴桃叶片，进行处理，所述处理包括：固定、冲洗、脱水、干燥，处理后的叶片进行扫描电镜测试，观察叶片表皮微形态，叶片腹面上表皮细胞表面有突起且细胞间隙线条轮廓模糊为雌株，细胞表面光滑且细胞间隙线条轮廓清晰为雄株，通过细胞表面是否具有突起及细胞间间隙能完全区分开猕猴桃雌雄株个体，本发明专利技术的鉴别方法适用于毛花猕猴桃、中华猕猴桃、美味猕猴桃，通用性好、操作简单、稳定性好、准确性高。准确性高。准确性高。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法


[0001]本专利技术涉及猕猴桃雌雄株鉴别方法
，具体涉及一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法

技术介绍

[0002]猕猴桃雌雄异株，雌株和雄株在生产种具有不同的经济效益，众所周知，作为果树类经济作物，其雌株的培育价值、经济价值和生产需求明显大于雄株，生产中大量种植雌株可提高猕猴桃的产量，目前的人工育种工作也主要集中在雌性品种选育方面。
[0003]目前，已有研究人员开展了用于幼苗早期性别鉴定的标记或方法，如，SmX和SmY1是由Gill等通过集团分离分析法(Bulk Segregant Analysis，BSA)，利用二倍体中华猕猴桃实生群体开发的SCAR(sequencec haract erizedamplified region)标记(GILL GP,HARVEY CF,GARDNER RC,et al.Development of sex
‑
linked PCR markers for gender identification in Actinidia.Theoretical&Applied Genetics,1998,97(3):439
‑
445.)，其中，SmX为雌性特异性标记，SmY1为雄性特异性标记；然而，上述测试方法通用性较差，测试过程操作复杂，所需人力和时间成本较高。鉴于此，开发一种适用于鉴别多个品种猕猴桃的鉴别方法，对猕猴桃的选育和生产都具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法，包括以下步骤：
[0005](1)取猕猴桃叶片，进行处理，所述处理包括：固定、冲洗、脱水、干燥；
[0006](2)处理后进行扫描电镜测试，观察叶片表皮微形态，叶片腹面上表皮细胞表面有突起且细胞间隙线条轮廓模糊为雌株，细胞表面光滑且细胞间隙线条轮廓清晰为雄株。
[0007]优选的，所述处理具体包括以下步骤：
[0008]S1、在叶片上取片段；
[0009]S2、向所述片段中加入质量分数为2.5％的戊二醇溶液，使片段沉于液面以下，在4℃下固定3.5
‑
4h；
[0010]S3、用质量分数为0.1％的磷酸缓冲液冲洗至少10
‑
15min；
[0011]S4、依次用体积浓度为30％、50％、70％、80％、95％的乙醇溶液脱水、用体积浓度为95％的乙醇溶液脱水、用无水乙醇脱水，最后用异戊醇溶液处理；
[0012]S5、干燥。
[0013]优选的，S1中，所述片段取自叶片的腹面。
[0014]优选的，S1中，所述片段的尺寸为2
‑
3mm
×5‑
6mm
[0015]优选的，S2中，所述戊二醇溶液的pH＝6.8。
[0016]优选的，S3中，所述磷酸缓冲溶液的pH＝6.8。
[0017]优选的，S4中，依次用体积浓度为30％、50％、70％、80％、95％的乙醇溶液脱水10
‑
15min、用体积浓度为95％的乙醇溶液脱水10
‑
15min，用无水乙醇脱水3次，每次10
‑
15min，最后用异戊醇溶液脱水3次，每次10
‑
15min。
[0018]优选的，S5中，所述干燥具体为：在冷冻干燥机内使温度降至
‑
30℃预冻1
‑
1.5h，然后抽真空使冻干箱内压力为60Pa，干燥6
‑
8h，冻干箱内压力到65kPa时将温度升至30℃持续1
‑
1.5h，最后再放入二氧化碳临界点干燥仪直至完全干燥。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术对猕猴桃叶片进行处理，利用扫描电镜对猕猴桃叶片上的表皮进行微形态观察，通过细胞表面是否具有突起及细胞间间隙能完全区分开猕猴桃雌雄株个体，本专利技术的鉴别方法适用于毛花猕猴桃、中华猕猴桃、美味猕猴桃，通用性好、操作简单、稳定性好、准确性高。
附图说明
[0020]图1为毛花猕猴桃的叶片腹面上表皮细胞的扫描电镜图，A为雌株，B为雄株；
[0021]图2为中华猕猴桃的叶片腹面上表皮细胞的扫描电镜图，A为雌株，B为雄株；
[0022]图3为美味猕猴桃的叶片腹面上表皮细胞的扫描电镜图，A为雌株，B为雄株。
具体实施方式
[0023]下面对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0024]实施例1
[0025]S1、取材：选取5株毛花猕猴桃，每株取三个叶片，用纯净水将叶片两侧清洗干净，在每个叶片腹面用双面刀片取五个2mm
×
5mm的片段。
[0026]S2、固定：加入质量分数为2.5％(pH＝6.8)的戊二醛固定，使叶片沉于液面以下后，置于4℃冰箱中固定4h。
[0027]S3、冲洗：用质量分数为0.1％(pH＝6.8)的磷酸缓冲液冲洗三次，每次15min。
[0028]S4、脱水：分别用体积浓度为30％、50％、70％、80％、95％的乙醇溶液脱水10min，用体积浓度为95％的乙醇溶液脱水15min；用无水乙醇脱水3次，每次15min；最后用异戊醇溶液处理3次，每次15min。
[0029]S5、将处理的材料放在冷冻干燥机内使温度降至
‑
30℃预冻1h，然后抽真空使冻干箱内压力为60Pa进行干燥6h，冻干箱内压力到65kPa时将温度升至30℃持续1h，最后再放入二氧化碳临界点干燥仪，在37℃，72.8个大气压的条件下干燥至完全干燥。
[0030]S6、粘样：将猕猴桃叶上表皮观察面向上用导电胶带粘贴在扫描电镜样品台上。
[0031]S7、镀膜：用JFC
‑
1600型离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层15nm厚的金膜。将处理好的样品放入样品盒中，在扫描电镜下观察。
[0032]S8、记录分析叶片表皮微形态，叶片腹面上表皮细胞表面有突起且细胞间隙线条轮廓模糊为雌株，细胞表面光滑且细胞间隙线条轮廓清晰为雄株。
[0033]实施例2
[0034]S1、取材：选取5株中华猕猴桃，每株取三个叶片，用纯净水将叶片两侧清洗干净，
在每个叶片腹面用双面刀片取五个3mm
×
5mm的片段。
[0035]S2、固定：加入质量分数为2.5％(pH＝6.8)的戊二醛固定，使叶片沉于液面以下后，置于4℃冰箱中固定3.5h。
[0036]S3、冲洗：用质量分数为0.1％(pH＝6.8)的磷酸缓冲液冲洗三次，每次10min。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取猕猴桃叶片，进行处理，所述处理包括：固定、冲洗、脱水、干燥；(2)处理后的叶片进行扫描电镜测试，观察叶片表皮微形态，叶片腹面上表皮细胞表面有突起且细胞间隙线条轮廓模糊为雌株，细胞表面光滑且细胞间隙线条轮廓清晰为雄株。2.根据权利要求1所述的一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法，其特征在于，所述处理具体包括以下步骤：S1、在叶片上取片段；S2、向所述片段中加入质量分数为2.5％的戊二醇溶液，使片段沉于液面以下，在4℃下固定3.5
‑
4h；S3、用质量分数为0.1％的磷酸缓冲液冲洗至少10
‑
15min；S4、依次用体积浓度为30％、50％、70％、80％、95％的乙醇溶液脱水、用体积浓度为95％的乙醇溶液脱水、用无水乙醇脱水，最后用异戊醇溶液脱水；S5、干燥。3.根据权利要求2所述的一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法，其特征在于，S1中，所述片段取自叶片的腹面。4.根据权利要求2所述的一种鉴别猕猴桃雌雄株的方法，其特征在于，S1中，所述片段的尺寸为2
‑
3mm
×5‑
6mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：张九东，徐伟君，雷靖，张雨娜，支佳，王茸茸，邓文珍，梁玉风，李悦，于晓峰，
申请(专利权)人：西安文理学院，
类型：发明
国别省市：