获得α-法尼烯以及β-法尼烯的重组微生物及其构建方法技术

本发明专利技术公开了获得α

【技术实现步骤摘要】
获得
α
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法尼烯以及
β
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法尼烯的重组微生物及其构建方法


[0001]本专利技术属于合成生物学领域，具体涉及一种获得α
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法尼烯以及β
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法尼烯的重组微生物及其构建方法。

技术介绍

[0002]法尼烯是一种倍半萜化合物，其在农业、工业生产中具有广泛应用。目前法尼烯可作为现有基于石油的二烯烃单体替代物用于增粘树脂的生产之中，使其软化点、稳定性和热稳定性都有所提高。同时，法尼烯是众多植物挥发性物质的的主要成分，根据植物
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害虫之间的信号联系机理以及植物挥发性物质在害虫诱杀方面的天然优势，法尼烯常用作害虫引诱剂，结合昆虫诱杀器用于农业生产。聚合法尼烯也作为胶基成分代替源自于石油原料的人造聚合物，由于其为食品可接受聚合物，故也用于口香胶基等食品之中。目前通过植物提取、化学合成和生物合成方法得到法尼烯。微生物发酵可不受植物生长、杂质众多等因素限制，成本较低且比起化学合成法，其对环境污染较小，是一种经济、绿色的合成方式。
[0003]目前针对于法尼烯的微生物合成主要采用大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母，均获得了一定的进展。而目前所使用的生产α
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法尼烯的酶基本均是苹果来源，而β
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法尼烯合酶均是青蒿来源。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一在于提供一种性能优异的法尼烯合酶，以及所述法尼烯合酶在构建产法尼烯的重组微生物中的应用。
[0005]一种性能优异的法尼烯合酶，为α
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法尼烯合酶或β
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法尼烯合酶；其中，α
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法尼烯合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的茶树来源的α
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法尼烯合酶，或以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的茶树来源的α
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法尼烯合酶为基础，含有下述突变中的一种或两种的α
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法尼烯合酶突变体：W281C、C455N；或α
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法尼烯合酶为氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的梨来源的α
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法尼烯合酶，或以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的梨来源的α
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法尼烯合酶为基础，含有下述突变中的一种或多种的α
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法尼烯合酶突变体：G252E、D10G、A78T；β
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法尼烯合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的洋甘菊来源的β
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法尼烯合酶，或以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的洋甘菊来源的β
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法尼烯合酶为基础，含有下述突变中的一种或多种的β
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法尼烯合酶突变体：F11S、M35T、T319S、I434T、I460V、K59R、S204Y。
[0006]上述法尼烯合酶合成法尼烯的性能更为优异，其可用于生产法尼烯或构建产法尼烯的重组微生物，提高法尼烯的产量。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供一种产法尼烯的重组微生物，以及所述重组微生物的构建方法和在生产法尼烯中的应用。
[0008]一种产法尼烯的重组微生物，为产α
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法尼烯的重组微生物或产β
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法尼烯的重组微生物。其中，产α
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法尼烯的重组微生物中基因的拷贝数为ERG10：ERG13：tHMG1：ERG12：ERG8：MVD1：IDI1：ERG20：aFS＝2：2：X：2：2：2：2：2：X，X为大于等于1的整数；产β
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法尼烯的重组微
生物中基因的拷贝数为ERG10：ERG13：tHMG1：ERG12：ERG8：MVD1：IDI1：ERG20：bFS＝2：2：X：2：2：2：2：2：X，X为大于等于1的整数。其中，ERG10为编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因，ERG13为编码HMG
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CoA合酶的基因，tHMG1为编码HMG
‑
CoA还原酶的基因，ERG12为编码甲羟戊酸激酶的基因，ERG8为编码甲羟戊酸
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磷酸激酶的基因，MVD1为编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因，IDI1为编码异戊二烯焦磷酸异构酶的基因，ERG20为编码法尼烯焦磷酸合酶的基因，aFS为编码α
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法尼烯合酶的基因，bFS为编码β
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法尼烯合酶的基因。优选的，aFS编码的α
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法尼烯合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的茶树来源的α
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法尼烯合酶或氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的梨来源的α
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法尼烯合酶或上述α
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法尼烯合酶突变体；bFS编码的β
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法尼烯合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的洋甘菊来源的β
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法尼烯合酶或上述β
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法尼烯合酶突变体，更为优选的，aFS编码的α
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法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示(在梨来源的α
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法尼烯合酶的基础上，含有G252E突变)；bFS编码的β
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法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示(在洋甘菊来源的β
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法尼烯合酶的基础上，同时含有F11S、M35T、T319S、I434T、I460V突变)，或bFS编码的β
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法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示(在洋甘菊来源的β
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法尼烯合酶的基础上，同时含有F11S、M35T、T319S、I434T、I460V、K59R、S204Y突变)。
[0009]更为优选的，ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20在NCBI中的Accession/GENE id见下表。
[0010][0011][0012]优选的，所述的产法尼烯的重组微生物以酿酒酵母为宿主；更为优选的，所述的产法尼烯的重组微生物以酿酒酵母CEN.PK2
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1D菌株为宿主。
[0013]优选的，所述的产α
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法尼烯的重组微生物在酿酒酵母CEN.PK2
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1D的基础上，含有5个SEQ ID NO.3所示或SEQ ID NO.4所示α
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法尼烯合酶的编码基因，含有额外的MVA途径基因(ERG10、ERG13、THMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1)以及额外一个ERG20基因，额外一个tHMG1基因。更为优选的，所述的产α
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法尼烯的重组微生物为将下表所示基因通过质粒转到酿酒酵母CEN.PK2
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1D中，使相关基因整合到酿酒酵母CEN.PK2
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1D染色体特定位置后得到。
[0014][0015]优选的，所述的产β
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种法尼烯合酶，其特征在于：所述的法尼烯合酶为α
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法尼烯合酶突变体或β
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法尼烯合酶突变体；所述的α
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法尼烯合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的茶树来源的α
‑
法尼烯合酶，或以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的茶树来源的α
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法尼烯合酶为基础，含有下述突变中的一种或两种的α
‑
法尼烯合酶突变体：W281C、C455N；或α
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法尼烯合酶为氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的梨来源的α
‑
法尼烯合酶，或以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的梨来源的α
‑
法尼烯合酶为基础，含有下述突变中的一种或两种的α
‑
法尼烯合酶突变体：G252E、D10G、A78T；所述的β
‑
法尼烯合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的洋甘菊来源的β
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法尼烯合酶，或以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的洋甘菊来源的β
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法尼烯合酶为基础，含有下述突变中的一种或多种的β
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法尼烯合酶突变体：F11S、M35T、T319S、I434T、I460V、K59R、S204Y。2.权利要求1所述的法尼烯合酶的在生产法尼烯或构建产法尼烯的重组微生物中的应用。3.一种产法尼烯的重组微生物，其特征在于：所述的重组微生物为产α
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法尼烯的重组微生物或产β
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法尼烯的重组微生物；所述的产α
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法尼烯的重组微生物中基因的拷贝数为ERG10：ERG13：tHMG1：ERG12：ERG8：MVD1：IDI1：ERG20：aFS＝2：2：X：2：2：2：2：2：X，X为大于等于1的整数；所述的产β
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法尼烯的重组微生物中基因的拷贝数为ERG10：ERG13：tHMG1：ERG12：ERG8：MVD1：IDI1：ERG20：bFS＝2：2：X：2：2：2：2：2：X，X为大于等于1的整数；其中，ERG10为编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因，ERG13为编码HMG
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CoA合酶的基因，tHMG1为编码HMG
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CoA还原酶的基因，ERG12为编码甲羟戊酸激酶的基因，ERG8为编码甲羟戊酸
‑5‑
磷酸激酶的基因，MVD1为编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因，IDI1为编码异戊二烯焦磷酸异构酶的基因，ERG20为编码法尼烯焦磷酸合酶的基因，aFS为编码α
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法尼烯合酶的基因，bFS为编码β
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法尼烯合酶的基因。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，叶紫玲，石彬，黄阳磊，邝照琳，林晓莹，黄曼，马田，
申请(专利权)人：武汉合生科技有限公司，
类型：发明
国别省市：