弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用，所述弧菌噬菌体组合物包括：弧菌噬菌体VpST

【技术实现步骤摘要】
弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]我国是水产养殖大国。近年来，我国的水产养殖业获得迅猛发展。随着海水养殖规模的日益扩大和集约化养殖方式的不断推广，疾病的频繁发生对水产规模化养殖的健康发展造成了严重的威胁。水产养殖的病原体主要包括细菌、病毒、寄生虫等，其中细菌性疾病是对危害程度较为严重的一类疾病。
[0003]弧菌是能运动的芽孢短杆状细菌，广泛分布于近海岸、河口海区海水及生物体内，是海洋中最常见的细菌类群之一，同时也是引起海水养殖鱼虾细菌性疾病最重要的病原菌。弧菌的致病强度与宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素有关，属于条件性致病菌，其主要通过口或伤口感染，产生毒素，致使伤口肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变从而导致鱼虾类的死亡。由弧菌引起的疾病又称弧菌病，具有“流行面积广、发病率高、致死性强”等特点，是水产养殖动物的主要疾病，同时也被确定为是阻碍水产养殖业发展的重要限制性因素，给养殖业造成了巨大的危害。其中鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和杀鲑弧菌(Vibriosalmonicida)等弧菌引起的弧菌病被认为是鱼虾类养殖中最为严重的病害之一。早期死亡综合征，也称作肝胰腺急性坏死综合征影响的主要对虾种类包括凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾在内的多个主养品种，其中凡纳滨对虾和斑节对虾的死亡率最高。由于该病发病急、造成的死亡率高、流行范围广，对对虾养殖业危害严重，备受关注。亚利桑那大学的研究已经确定，该疾病是由细菌剂副溶血弧菌引起的，副溶血弧菌通过口腔传播并定殖于虾的胃肠道，并产生毒力蛋白，导致虾消化器官的组织破坏和功能障碍。
[0004]目前针对水产养殖相关动物疾病的预防和控制方法主要以化学抗生素法和免疫疫苗法，其中以化学抗生素使用为主。作为当前控制水产动物疾病的主要手段，化学抗生素法具有使用方便、见效快和疗效好等优点。但是，大批量频繁使用抗生素在控制病原菌的同时，极大了助长了病原菌的耐药性，并加速了广谱耐药菌的产生。这使得致病菌的耐药性问题日益严重。此外，化学药物残留也是导致人类食源性疾病产生的重要原因之一，对人类健康造成严重危害。
[0005]噬菌体又称细菌性病毒，是一类专一性裂解细菌的病毒，在环境中分布广泛、种类多样、结构简单，具有很强的宿主特异性。最重要的一点，噬菌体裂解细菌的机制不受细菌耐药性的影响，其通过受体识别从而吸附在特定宿主菌表面，将自身遗传物质注入宿主体内进行自我复制组裝，并最终通过裂解宿主菌释放子代从而实现自我的生长繁殖。因此，噬菌体疗法是一种很有前景的预防和治疗弧菌疾病方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术中抗生素使用受限及耐药菌泛滥的问题；同时，针对噬菌体培养过程中可能伴随宿主菌毒力蛋白释放的问题，本专利技术提供一种弧菌噬菌体组合物，及无害化的噬菌体制备方法和应用。
[0007]为此，本专利技术提供了一种弧菌噬菌体组合物，包括：弧菌噬菌体VpST
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1、弧菌噬菌体VpA
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1和弧菌噬菌体VpC
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1中的至少一种，所述噬菌体VpC
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1 的保藏编号为CCTCC NO:M 20211704，保藏日期为2021年12月30日，分类命名为Myoviridae。
[0008]具体的，上述弧菌噬菌体组合物的效价为109PFU/mL
‑
10
12
PFU/mL。
[0009]具体的，上述弧菌噬菌体组合物的感染复数MOI为0.1
‑
10。
[0010]本专利技术还提供了上述弧菌噬菌体组合物的制备方法，包括以下步骤：选择无致病基因的弧菌作为宿主培养弧菌噬菌体，培养时间为12
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20小时，培养温度为28℃
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32℃，转速为200rpm
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240rpm，培养结束后离心过滤去除宿主菌。
[0011]具体的，上述无致病基因的弧菌为溶藻弧菌VA
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3和/或溶藻弧菌 VP
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18。
[0012]具体的，上述弧菌杀菌剂还包括以所述弧菌噬菌体组合物的体积计为 30％
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60％的辅剂。
[0013]具体的，上述辅剂包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的至少一种。
[0014]本专利技术提供的这种弧菌杀菌剂在控制由弧菌引起的水产动物致病菌中有广泛应用。
[0015]具体的，以养殖水体体积计，所述弧菌杀菌剂的使用剂量为10mL/cm3。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
[0017](1)本专利技术提供的这种弧菌噬菌体组合物可裂解耐药菌，治疗弧菌感染引起的疾病，在复杂细菌的环境，例如动物肠道发生杀菌作用时，不会对益生菌造成伤害，效价较高，大规模生产成本低，防治效果好。此外为避免单一噬菌体容易产生抗性的问题，本专利技术提供的弧菌噬菌体组合物可选择包括多种弧菌噬菌体，形成噬菌体鸡尾酒组合，扩大宿主谱范围，有效抑制宿主菌抗性的产生，具有快速高效的裂解作用，并且通过噬菌体之间的协同作用降低了同条件下单株噬菌体达到相同杀菌效果所需剂量，起到了节约成本的作用。
[0018](2)噬菌体目前的传统制备方式是由需杀灭的目标宿主菌培养，由于使用致病性弧菌培养噬菌体时，噬菌体会裂解弧菌导致弧菌体内毒力蛋白的释放，使噬菌体培养液含有毒力蛋白，对后续噬菌体的治疗和预防效果造成影响。本专利技术提供了一种利用无致病性弧菌制备弧菌噬菌体组合物的方法，制备的噬菌体组合物内不含导致水产动物发病的毒力蛋白，有效避免了噬菌体培养液含有毒力蛋白而对后续噬菌体的应用产生影响。
[0019]以下将结合附图对本专利技术做进一步详细说明。
附图说明
[0020]图1是本专利技术实施例1中弧菌Pir致病基因检测结果示意图。
[0021]图2是本专利技术实施例1中10株包含Pir致病基因的弧菌的进化树。
[0022]图3是本专利技术实施例3中VpST
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1、VpA
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1和VpC
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1及其组合对4株致病弧菌的抑菌曲线；其中A为对副溶血性弧菌VP
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6的抑菌曲线；B为对副溶血性弧菌VP
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B3的抑菌曲线；C为对副溶血性弧菌VPAH
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1的抑菌曲线； D为对副溶血性弧菌VPAH
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5的抑菌曲线。
[0023]图4是本专利技术实施例5中VpST
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1、VpA
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1和VpC
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1在不同的MOI下对宿主菌VP
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6的抑菌曲线。
具体实施方式...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种弧菌噬菌体组合物，其特征在于，包括：弧菌噬菌体VpST
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1、弧菌噬菌体VpA
‑
1和弧菌噬菌体VpC
‑
1中的至少一种，所述噬菌体VpC
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1的保藏编号为CCTCC NO:M 20211704，分类命名为Myoviridae。2.如权利要求1所述的弧菌噬菌体组合物，其特征在于：所述弧菌噬菌体组合物的效价为109PFU/mL
‑
10
12
PFU/mL。3.如权利要求1所述的弧菌噬菌体组合物，其特征在于：所述弧菌噬菌体组合物的感染复数MOI为0.1
‑
10。4.如权利要求1
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3任意一项所述的弧菌噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：选择无致病基因的弧菌作为宿主培养弧菌噬菌体，培养时间为12
‑
20小时，培养温度为28℃
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【专利技术属性】
技术研发人员：马迎飞，黄志鹏，翁奥婷，
申请(专利权)人：深圳市澳华集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：