一种比率型电化学适配体传感器的制备方法技术

本发明专利技术属于生物传感器技术领域，公开了一种可检测牛奶中卡那霉素（KAN）的比率型电化学适配体传感器制备及使用方法。本发明专利技术制备的比率型电化学适配体传感器基于二茂铁（Fc）标记引物和石墨炔

【技术实现步骤摘要】
一种比率型电化学适配体传感器的制备方法


[0001]本专利技术提供一种检测牛奶中卡那霉素残留的比率型电化学适配体传感器的制备方法，属于生物传感器


技术介绍

[0002]卡那霉素（KAN）是一种重要的氨基糖苷类抗生素，已用于治疗严重细菌感染和结核病，也被广泛用于畜牧业中治疗动物的各种疾病和作为动物生长促进剂，然而，卡那霉素的滥用会造成在食品中残留，通过食物链在人身体中积累，对人类健康构成严重威胁，包括耳毒性、肾毒性、过敏反应、甚至导致致病菌株产生抗生素耐药性等，为了消费者的健康，欧盟（EU）已经确定了牛奶中的卡那霉素最大残留限（MRLs）为150 μg kg
‑1，目前，食品中卡那霉素残留的测定方法很多，包括毛细管电泳法（CE），薄层色谱法（TLC），高效液体色谱（HPLC）、气体色谱
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质谱（LC
‑
MS）、固相萃取（SPE）等，尽管这些分析方法对卡那霉素检测是成功的，但它们存在一些限制，涉及样品预处理繁琐，耗时和价格昂贵等。
[0003]近些年，一些传感器的报道，如适配体传感器和免疫传感器，为开发低成本、快速、简单、选择性好的检测卡那霉素方法提供了方向，适配体（Apt）是一种在体外通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）获得的单链核酸识别元件，能够识别和特异性结合细菌、金属离子、农兽药和蛋白质等多种目标，其具有体外合成，高稳定性、易于标记和可定制结构的独特优势。电化学适配体传感器通过Apt与换能器耦合产生电化学信号，由于其样品使用量低、简单、易于小型化等优点，已经开始成为越来越多的临床诊断和食品分析研究的热点，传统的电化学适配体传感器是基于在Apt修饰的电极上直接捕获靶标，由形成的Apt
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靶标复合物造成电信号变化进行定量分析，然而这些方法往往灵敏度相对较低，为了获得高灵敏度，实现对低水平分析物的准确检测，会采用不同的信号放大技术，然而在放大信号的过程中，由于环境变化、电极表面修饰Apt及其他材料密度的变化等会造成干扰，目前，提高灵敏度及增强抗干扰能力是电化学传感器面临的挑战。
[0004]电极表面修饰导电性好的纳米材料对提高电化学适配体传感器的灵敏度起着至关重要的作用，纳米掺杂氧化物中的氧化锡锑（ATO）由于其较好的稳定性、低成本和良好的电导率，是一种很有前途的导电材料。纳米金颗粒（AuNPs）具有如易制备、成本低、稳定性高、优良的生物相容性和电子特性等优异特性，还可以作为固定探针分子的理想纳米载体，进一步提高传感器性能。通过共价结合与被修饰巯基的Apt形成金硫键连接，或以极高的亲和力与设计有连续腺嘌呤（polyA）的Apt吸附。polyA
‑
Apt相较于硫化DNA，成本更低、能够可控地调整DNA分子的密度。基于酶辅助实现信号放大技术，也是一种很有前途的新策略，核酸外切酶Ⅰ（Exo I）可以将单链DNA（ssDNA）从3
’
端依次水解成单核苷酸，进而释放靶标实现目标物循环重复利用，实现信号放大，由于不需要特异性的识别序列，非常适合构建通用的生物传感平台。
[0005]使用单电信号输出的电化学传感器容易出现假阴性或假阳性，相比之下，具有比率双信号的电化学传感器具有内校准因子，可以强化干扰能力，提高检测精度，可以通过引
入两个独立的电信号分子来构建比率方法，如亚甲基蓝（MB）、甲苯胺蓝（TB）、二茂铁（Fc），其在适配体传感器中产生电信号的方式主要有把电信号分子直接标记在核酸链上或利用不同核酸（ssDNA/dsDNA/G
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quadruplex）对=电信号分子结合能力不同，目前，通过将电信号分子与纳米材料结合，制备具有电化学功能的纳米复合材料，具有更好的固定性及稳定性，在构建比率型电化学适配体传感器方面具有很大的潜力，因此选择一种新型的二维碳纳米材料
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石墨炔（GDY），由sp2和sp杂化碳原子组成平面网络结构，与其他碳纳米材料相比，GDY是一种富含π
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电子的独特碳异素异形体，它具有均匀分布的空隙和优异的负载性，这些特性使GDY适合与MB电信号分子结合制备信号稳定的纳米复合材料。
[0006]综上所述，我们设计一种Fc标记的引物，制备了电化学功能的纳米复合材料GDY
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MB，当KAN存在时引起Fc和MB两个信号变化，构建比率型电化学适配体传感器，并结合Exo I引起的靶标循环和CS
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ATO/AuNPs纳米材料辅助的双信号放大策略检测卡那霉素。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种检测卡那霉素残留的比率型电化学传感器的制备方法，实现卡那霉素高灵敏度的电化学检测。
[0008]本专利技术的第二个目的是放大比率型电化学传感器的信号，提高灵敏度。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种比率型电化学适配体传感器的制备方法，包括以下步骤的方法制备而成。
[0010]（1）取等体积的Apt和其互补引物，使用TE缓冲液（含50 mM氯化钠）制备得到2.5 μM互补链溶液。
[0011]（2）在离心管中制备目标循环产物，当加入KAN时，KAN特异性结合互补链中的Apt，释放引物，引物中设计的自身互补部分通过碱基互补配对形成发夹结构，Exo I将游离出的Apt切割，释放目标物进行靶标循环，继续释放引物。
[0012]（3）制备GDY
‑
MB，AuNPs和ATO，处理裸金电极，用氧化铝浆液仔细抛光，然后在乙醇和超纯水中超声5 min，直到铁氰化钾溶液中循环伏安图的峰值电位差低于80 mV。
[0013]（4）在电极表面逐层修饰ATO，GDY
‑
MB和AuNPs，再滴加循环产物，等待polyA与AuNPs结合，从而使HP紧密的固定在电极表面，当目标物越多，生成的发夹结构越多，Fc信号越大，MB信号因为酶、Apt、纳米材料等因素影响也会发生减弱，计算Fc和MB的比值与KAN的对应关系，得到KAN的检测范围和检测限。
[0014]（5）对牛奶样品进行去脂去蛋白等预处理，取上清进行应用评估。
[0015]本专利技术的有益效果。
[0016]（1）基于GDY
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MB复合材料和Fc标记引物制备了一种比率型电化学传感器，实现了卡那霉素高灵敏检测目的。
[0017]（2）Exo I诱导的目标再循环和AuNPs/ATO辅助信号放大实现了对电化学检测信号的双重放大。
[0018]（3）所制备的适配体传感器不仅适用于牛奶中卡那霉素的检测，还有望通过简单地改变Apt实现对其他抗生素的灵敏检测和大规模定量，在食品安全、环境监测、疾病诊断等方面具有巨大的应用潜力。
附图说明
[0019]图1是本专利技术制备的比率型电化学适配体传感器示意图。
[0020]图2是ATO透射电镜图像。
[0021]图3是AuNPs透射电镜图像。
[0022]图4是G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种比率型电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于：设计一种5'端二茂铁（Fc）标记的引物，制备电化学功能的纳米复合材料石墨炔
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亚甲基蓝（GDY
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MB），当卡那霉素（KAN）存在时会引起Fc和MB两电信号变化，构建比率型电化学适配体传感器，并结合核酸外切酶I（Exo I）引起的靶标循环和氧化锡锑和纳米金（ATO/AuNps）纳米材料导电辅助的双信号放大策略检测牛奶中KAN。2.根据权利要求1所述的设计一种5'端Fc标记引物的方法，其特征在于：设计部分序列能够与适配体（Apt）部分序列杂交形成双链的引物，在引物的5
’
端标记二茂铁电信号分子，在3
’
端增加polyA短核酸链并在末端腺嘌呤上进行磷酸化修饰防止被Exo I剪切，由于双链的刚性结构Fc远离电极表面，Fc电信号弱，当KAN存在时，特异性结合Apt释放引物，引物中设计的自身互补部分通过碱基互补配对形成发夹结构，Fc接近电极表面，引起Fc电信号增加。3.根据权利要求1所述的结合Exo I引起的靶标循环的方法，其特征在于：取等体积的Apt和其互补引物，使用TE缓冲液配置成互补链溶液，然后取互补链，KAN，Exo I酶缓冲液和Exo I酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李发兰，郜晓琳，孙霞，郭业民，杨青青，张妍妍，孙志聪，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：