一种组织工程表皮模型及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种组织工程表皮模型及其构建方法。所述构建方法以聚对苯二甲酸乙二醇酯多孔膜为组织工程支架材料，经促贴壁试剂处理之后在上面接种原代角质形成细胞，用培养基A浸没培养1～2天，之后用培养基B在气液面继续培养7～15天即可。所述构建方法改善了传统聚碳酸酯膜作为支架材料构建表皮模型的局限性，并且HE染色结果显示，表皮各层分化清晰，细胞形态良好，与国内外知名表皮模型相比，所述构建方法得到的表皮模型与人体皮肤最为接近。建方法得到的表皮模型与人体皮肤最为接近。建方法得到的表皮模型与人体皮肤最为接近。

【技术实现步骤摘要】
一种组织工程表皮模型及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种组织工程表皮模型及其构建方法。

技术介绍

[0002]出于对动物福利和3R原则的重视，欧盟化妆品指令(76/768/EEC)禁止所有采用动物实验的化妆品和个人护理用品在欧盟市场销售，并发展替代性刺激实验。美国环境保护署(EPA)也宣布，到2035年，EPA将不再支持使用哺乳动物来评估化学品安全性的研究。
[0003]因此，各种用于化妆品体外皮肤刺激实验的人皮肤模型已被建立用于进行替代实验。其中OECD认证的可用于体外皮肤刺激试验的表皮模型有四款，包括法国欧莱雅的Episkin
TM
、SkinEthic
TM RHC，美国Mattek的EpiDerm
TM
和日本J
‑
TEC的LabCyte EPI
‑
MODEL。此外国内博溪的虽未获OECD认证，但其表皮的基底层、棘层、颗粒层和角质层分化完整，同样是一款比较接近人体皮肤的表皮模型。除了这五种表皮模型以外，其他机构和实验室构建的表皮模型或各细胞层分化不清晰，或角质层分化不完全，或细胞层数太少，与人体皮肤的表皮层相差过大，无法达到替代实验的目的。
[0004]在现有技术中，专利CN 108018256 A公开了一种人三维表皮模型的构建方法和培养基，所培养的表皮模型切片显示，表皮各层分化与人体表皮相差甚远，且实施例2的表皮模型细胞层少，分化不完全。专利CN 107267441 B公开了一种用于筛选治疗皮肤抗炎抗敏药物的三维皮肤模型，其表皮层没有分化出各功能层，也没有角质层，只是一种细胞的堆积，不存在角质层的屏障功能，不能作为一种人体皮肤的检测替代物。
[0005]此外，在表皮模型的设计方面，专利CN 107164315 A、CN 107287150 B、CN 105734009 B等构建的表皮模型也都采用了PC膜作为支架材料。PC膜是一种有利于细胞贴壁的材料，但其透光性很差，细胞接种初期无法在显微镜下观察细胞状态，出现细胞接种不均匀或细胞贴壁不良等问题时无法及时发现。而表皮模型的构建周期往往需要两周时间，如果细胞接种时发生了差错而未及时发现，会导致后期原料和时间的大量浪费。因此需要一种既有利于细胞贴壁，又有良好透光性的膜材料作为表皮模型的支架材料，能在种子细胞接种初期就能及时观察细胞状态。
[0006]故基于此，提出本专利技术技术方案。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提出一种基底层、棘层、颗粒层和角质层与人体皮肤更为接近的表皮模型构建方法，同时解决传统表皮模型构建方法在培养初期无法观察细胞生长状态的劣势。
[0008]本专利技术的方案是提供一种组织工程表皮模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
[0009](1)采用促贴壁试剂对聚酯膜进行包被，完成后得到包被聚酯膜；
[0010](2)将培养的原代角质形成细胞用胰酶消化，采用培养基A调整细胞密度后接种至
底部为包被聚酯膜的小室中；
[0011](3)于孔板中加入培养基A，将所述小室放入所述孔板中浸没培养，直至细胞分布均匀、贴壁；
[0012](4)所述浸没培养结束后，吸出所述小室内、外的培养基A，于所述小室外加入培养基B并使液面接触所述聚酯膜，气液培养即得到完整分化的表皮模型。
[0013]优选地，步骤(1)中，所述促贴壁试剂可以是胶原、细胞外基质、基质胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻连蛋白、MSC促贴壁试剂、多聚赖氨酸、任何包含RGD序列的多肽或其他商品化细胞贴壁粘附剂；更优选地，为I型胶原、IV型胶原、细胞外基质或基质胶。
[0014]优选地，步骤(1)中，所述聚酯膜为聚对苯二甲酸乙二醇酯多孔膜。
[0015]优选地，步骤(1)中，所述包被于室温条件下进行1h以上。
[0016]优选地，所述培养基A以K
‑
SFM为基础培养基，添加如下原料：牛垂体提取物1～50μg/ml、牛血清白蛋白0.1％～5％、硒1～50μg/ml、转铁蛋白1～50μg/ml、乙醇胺1～50μg/ml、胰岛素1～50μg/ml、表皮生长因子0.1～1ng/ml、氢化可的松0.1～5μg/ml、抗坏血酸1～50μg/ml、氯化钙0.03～0.5mM。
[0017]优选地，步骤(2)中，所述调整细胞密度至1～6
×
106/mL。
[0018]优选地，步骤(3)中，所述浸没培养的条件为：于37℃、5％CO2条件下培养24～48h。
[0019]优选地，所述培养基B以K
‑
SFM为基础培养基，添加如下原料：牛垂体提取物1～50μg/ml、牛血清白蛋白0.1％～5％、硒1～50μg/ml、转铁蛋白1～50μg/ml、乙醇胺1～50μg/ml、胰岛素1～50μg/ml、表皮生长因子0.1～1ng/ml、氢化可的松0.1～5μg/ml、油酸0.1～5μg/ml、亚油酸0.1～5μg/ml、抗坏血酸1～50μg/ml、氯化钙1～2mM。
[0020]优选地，步骤(4)中，所述气液培养的条件为：于37℃、5％CO2条件下培养7～15d。
[0021]基于相同的技术构思，本专利技术的再一方案是提供一种由上述构建方法得到的组织工程表皮模型，其包括聚酯膜、基底层、棘层、颗粒层和角质层，与人体表皮更为接近。
[0022]本专利技术的有益效果为：
[0023]本专利技术所述的组织工程表皮模型的构建方法，以聚对苯二甲酸乙二醇酯膜为组织工程支架材料，经促贴壁试剂处理之后接种原代角质形成细胞，以无血清培养基为培养体系，构建组织工程表皮模型。所述构建方法改善了传统聚碳酸酯膜作为支架材料构建表皮模型的局限性，并且HE染色结果显示，表皮各层分化清晰，细胞形态良好，与国内外知名表皮模型相比，所述构建方法得到的表皮模型与人体皮肤最为接近。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1是人体皮肤表皮切片HE染色图。
[0026]图2是Episkin
TM
表皮模型切片HE染色图。
[0027]图3是SkinEthic
TM RHC表皮模型切片HE染色图。
[0028]图4是LabCyte EPI
‑
MODEL表皮模型切片HE染色图。
[0029]图5是表皮模型切片HE染色图。
[0030]图6是EpiDerm
TM
表皮模型切片HE染色图。
[0031]图7是实施例1的表皮模型切片HE染色图。
[0032]图8是实施例2的表皮模型切片HE染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：(1)采用促贴壁试剂对聚酯膜进行包被，完成后得到包被聚酯膜；(2)将培养的原代角质形成细胞用胰酶消化，采用培养基A调整细胞密度后接种至底部为包被聚酯膜的小室中；(3)于孔板中加入培养基A，将所述小室放入所述孔板中浸没培养，直至细胞分布均匀、贴壁；(4)所述浸没培养结束后，吸出所述小室内、外的培养基A，于所述小室外加入培养基B并使液面接触所述聚酯膜，气液培养即得到完整分化的表皮模型。2.根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述促贴壁试剂为胶原、细胞外基质、基质胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻连蛋白、多聚赖氨酸中的一种。3.根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚酯膜为聚对苯二甲酸乙二醇酯多孔膜。4.根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述包被于室温条件下进行1h以上。5.根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，所述培养基A包括如下原料：牛垂体提取物1～50μg/ml、牛血清白蛋白0.1％～5％、硒1～50μg/ml、转铁蛋白1～50μg/ml、乙醇胺1～50μg...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱宗利，王星驰，刘传伟，
申请(专利权)人：上海美浮特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：