一种基于单分子自适应采样测序的病原微生物和耐药基因的检测方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于单分子自适应采样测序的病原微生物和耐药基因的检测方法及系统。所述方法包括如下步骤：使用单分子自适应采样测序方法获得临床样本原始序列集，将样本原始序列集进行质控得到高质量序列集；使用ARGpore2分析软件对所述高质量序列集进行分析，即得样本的病原微生物和耐药基因检测结果。通过本发明专利技术方案的方法，可以4.5小时快速识别病原体和抗生素耐药基因，方法简单，无需人工对样本进行特殊处理除去样本中高含量的宿主DNA，不会对样本中的微生物组造成破坏，可以使用一张测序芯片同时检测≥5个临床样本，节省了检测成本，可以广泛使用。可以广泛使用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于单分子自适应采样测序的病原微生物和耐药基因的检测方法及系统


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种基于单分子自适应采样测序的病原微生物和耐药基因的检测方法及系统。

技术介绍

[0002]感染性疾病为人类常见病，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等多类病原体，可引起包括中枢、血流、呼吸道、局灶感染等多种临床感染类型，严重威胁人类健康。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计，下呼吸道感染仍是世界上最致命的感染性疾病。感染性疾病发病率和死亡率的高低取决于感染部位，病原体和宿主等因素，尽早确定致病菌，使用抗生素可显著提高生存率，降低死亡率。近几年来，病原菌的耐药率明显升高，多重耐药菌和产广谱β
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内酰胺酶(ESBLs)细菌不断增多，给临床治疗带来极大困难。因此，明确的病原学诊断和病原耐药性信息，不仅可以指导下呼吸道感染的治疗还可以减少病原体耐药现象和药物不良反应、缩短病程、降低医疗费用、合理分配医疗资源。
[0003]快速准确的病原微生物诊断可以实现量身定制的治疗，减少广谱抗生素的过度使用。临床微生物检验室使用的金标准的培养和药敏试验太慢，典型的周转时间为48
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72h，并且临床敏感性低。分子方法可能有助于克服培养的局限性，通过在几个小时内识别病原体及其抗生素耐药性特征，实现早期靶向治疗并支持抗生素管理。尽管核酸扩增试验(包括PCR)快速且高度特异性/敏感性，但多重扩增存在局限性，并且还需要不断更新基于PCR的方法，以包括新出现的耐药基因和突变。
[0004]基于宏基因组测序的方法有潜力克服培养和PCR的缺点，方法是将速度与对临床样本所有存在微生物的全面覆盖相结合。但是呼吸道标本对宏基因组测序来说是一个困难的挑战，因为病原体负载量可变，存在共生呼吸道菌群，并且存在高比例的宿主与病原体核酸(痰中高达105:1)。相关技术曾采用Nanopore测序检测两名细菌性肺炎患者的感染性疾病病原体及其携带耐药基因，没有宿主细胞/DNA缺失，导致绝大多数测序 reads是人类来源的，只有一个和两个测序reads分别与感染病原体铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌对齐。但是通过引入宿主DNA缺失后，需要对特定样本进行调整，通常需要许多额外的步骤，会增加测序的时长和成本且在复杂的高宿主临床样本中仍表现不佳，需要更好的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于单分子自适应采样测序的病原微生物检测方法，能够在4.5小时内识别病原体和抗生素耐药基因，并且极大的降低检测成本。
[0006]本专利技术还提出一种基于单分子自适应采样测序的数据分析系统。
[0007]在本专利技术的第一方面，提出了一种基于单分子自适应采样测序的病原微生物检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0008]S1、使用单分子自适应采样测序方法获得样本原始序列集，将样本原始序列集进行质控得到高质量序列集；
[0009]S2、使用ARGpore2分析软件对所述高质量序列集进行分析，即得样本的病原微生物和耐药基因检测结果。
[0010]所述单分子自适应采样测序方法还包括将宿主序列进行过滤的步骤，所述步骤为以人类基因组为参考，以“Delete”的方式来耗竭样本中的宿主DNA，可以实时消除宿主 DNA序列，检测微生物DNA序列。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述宿主DNA序列为人源序列。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述人源序列为人类参考基因组GCA_000001405.28_GRCh38.p13。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述样本原始序列集为去除宿主序列的原始序列集。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述质控为过滤小于150bp的短序列，和剔除碱基质量分数低于7的序列。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述病原微生物选自细菌、真菌或者病毒中的至少一种。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，ARGpore2分析软件为自主构建用于临床样本单分子测序数据的分析软件。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述自主构建的ARGpore2分析软件是将ARGpore2 分析软件与病原微生物数据库和耐药基因数据库进行有机结合得到的。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述病原微生物数据库包括病原微生物参考序列数据库和病原微生物注释数据库。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述病原微生物数据库包括细菌数据库、真菌数据库和/或病毒数据库。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述病原微生物检测结果包括物种信息、物种reads、 reads占该物种比例、覆盖度、深度、耐药基因。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述耐药基因检测结果包括耐药基因信息、耐药基因的归属物种信息或携带耐药基因的质粒信息。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述分析包括使用ARGpore2分析软件将所述高质量序列集比对到病原微生物数据库系统参考基因上生成第一数据集(微生物物种鉴定结果)；使用ARGpore2分析软件将所述高质量序列集比对到耐药基因数据库系统参考基因上生成第二数据集(耐药基因检测结果)；将第一序列集和第二序列集进行关联生成第三序列集(携带耐药基因的物种及携带耐药基因)。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述方法还包括在测序前进行文库的构建步骤。
[0024]在本专利技术的第二方面，提供了一种基于单分子自适应采样测序的数据分析系统，所述系统包括：
[0025]数据库存储模块，用于存储病原微生物数据库和耐药基因数据库；
[0026]病原微生物鉴定模块，分别与数据输入模块和数据库存储模块连接，用于将所述序列集与所述病原微生物数据库进行比对，得到相应的病原微生物信息作为病原微生物鉴
定结果；
[0027]耐药基因鉴定模块，分别与数据输入模块和数据库存储模块连接，将所述序列集与耐药基因数据库的核酸序列信息进行比对，获得耐药基因的鉴定结果；
[0028]结果输出模块，与所述病原微生物鉴定模块和所述耐药基因鉴定模块相连接，用于输出病原微生物鉴定结果和耐药基因检测结果。
[0029]在本专利技术的一些实施方式中，所述数据分析系统为自主构建的ARGpore2分析软件。
[0030]根据本专利技术的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本专利技术方案基于单分子自适应采样测序的病原微生物检测方法，通过本专利技术方案的方法，无需人工对样本进行复杂前处理除去样本中高含量的宿主DNA，不会对样本中的微生物组造成破坏，可以4.5小时完成样本病原体的识别和抗生素耐药基因的检测，方法简单，可以使用一张芯片同时检测≥5个样本，节约了检测时间，节省了检测成本，可以广泛使用。
附图说明
[0031]下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的说明，其中：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于单分子自适应采样测序的病原微生物和耐药基因的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、基于单分子自适应采样测序方法获得样本原始序列集，将样本原始序列集进行质控得到高质量序列集；S2、使用ARGpore2分析软件对所述高质量序列集进行分析，即得样本的病原微生物和耐药基因检测结果。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单分子自适应采样测序方法还包括将宿主序列进行过滤的步骤，所述步骤为以人类基因组为参考，以“Delete”的方式来耗竭样本中的宿主DNA，可以实时消除宿主DNA序列，检测微生物DNA序列。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样本原始序列集为去除宿主序列的原始序列集。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质控为过滤小于150bp的短序列，和剔除碱基质量分数低于7的序列。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述ARGpore2分析软件为自主构建用于临床样本单分子测序数据的分析软件；优选地，所述自主构建的ARGpore2分析软件是将ARGpore2分析软件与病原微生物数据库和耐药基因数据库进行有机结合得到的。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述病原微生物数据库包括病原微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨亮，夏雨，程航，孙瑜鸿，杨青，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：