一种DNA甲基化检测方法及所用试剂技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，特别是涉及一种DNA甲基化检测方法及所用试剂。本发明专利技术公开了一种用于检测甲基化标志物的试剂，甲基化标志物为SDC2

【技术实现步骤摘要】
一种DNA甲基化检测方法及所用试剂


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，特别是涉及一种DNA甲基化检测方法及所用试剂。

技术介绍

[0002]表观遗传学改变在癌症的发生发展中起着重要的作用。表观遗传学指在DNA序列不发生改变的情况 下引起基因表达或功能变化，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰等
[1]。DNA甲基化是最主要的表观遗传 学修饰之一，参与细胞分化和发育、肿瘤发生和其他疾病。在正常哺乳动物细胞中，胞嘧啶甲基化(5
‑
m
C) 几乎仅存在于CpG二核苷酸中。一般情况下，70％
‑
90％的散在CpG位点是甲基化的，而未甲基化的CpG 通常只存在于被称为CpG岛的DNA区域。CpG岛是基因组中CpG二核苷酸的百分比高于随机分布的CpG 二核苷酸的预期区域，其所在位置多为基因启动子区域，与人类基因组编码基因相关，正常状态下通常处 于低甲基化状态
[2]。然而，对癌症表观基因组的全基因组研究表明，肿瘤细胞基因组中部分CpG岛存在异 常甲基化，表明CpG岛甲基化可能参与肿瘤的发生发展过程
[3]。基因启动子区域CpG岛的高甲基化可以 抑制下游基因的表达，促进肿瘤发生。研究表明，异常DNA甲基化在癌症中广泛存在，可能是肿瘤发生 过程中最早发生的变化之一
[4]。与体细胞突变分析相比，DNA甲基化分析在癌症检测方面具有以下优势： (1)异常甲基化在癌症早期就出现；(2)甲基化发生频率较基因突变更为频繁；(3)DNA甲基化多为 连续位点发生，有多个可检测的甲基化靶区，以及每个目标基因组区域内多个改变的CpG位点
[5]。
[0003]DNA甲基化的检测方法有多种，亚硫酸氢盐处理转化法一直是DNA甲基化分析的标准方法。该方法 于1992年由MARIANNE FROMMER首次提出
[6]，其原理是在酸性和高温条件下，亚硫酸氢盐将未甲基 化的胞嘧啶(C)脱氨转化成尿嘧啶(U)，通过PCR扩增将尿嘧啶(U)解读为胸腺嘧啶(T)，而甲基化 的胞嘧啶(
m
C)保持不变，随后用测序、定量PCR和芯片技术分析比较转化和未转化的DNA序列，来判 断DNA甲基化水平。基于亚硫酸氢盐的转化技术已经成为许多技术的基础，如WGBS、RRBS、MCTAseq、 靶向亚硫酸氢盐测序、甲基化阵列、MSP等
[7]。
[0004]然而，亚硫酸氢盐转化法有两大主要缺点：第一，亚硫酸氢盐处理是一种苛刻的化学反应，在酸性和 高温条件下，由于脱嘧啶作用，大部分DNA会被降解，导致该技术需要较多的起始量DNA，因此在微量 DNA样本中应用严重受限。第二，未修饰的胞嘧啶约占人类基因组中总胞嘧啶的95％，亚硫酸氢盐转化 将未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，经PCR扩增被识别为胸腺嘧啶，导致基因组由原本ATCG四种 碱基平衡组成降低为仅剩余ATG碱基为主，严重降低了DNA序列复杂度，导致引物探针设计困难、扩增 偏倚大、测序质量差、基因组覆盖不均和测序成本增加。且由于DNA序列复杂度降低，多重PCR扩增设 计尤其困难。
[0005]使用甲基化敏感的限制性内切酶切割特定核苷酸序列也是DNA甲基化研究的经典方法。这里使用的 甲基化敏感限制性内切酶(如HpaII、BstUI、AciI和Hin6I)切割未甲基化区域，当目标序列中的胞嘧啶 残基被甲基化时，这些酶将不能切断识别序列。Gabriel Beikircher等人将该技术和qPCR技术相结合，开 发了甲基化敏感的限制性内切酶(MSRE)
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技术实现思路

[0022]本专利技术要解决的技术问题是提供一种DNA甲基化检测方法、引物探针组合及其应用。
[0023]为解决上述技术问题，本专利技术提供一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测甲基化标志物的试剂，其特征在于：所述甲基化标志物为SDC2
‑
1、SDC2
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2、SDC2
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4、NDRG4
‑
1、NDRG4
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2、NDRG4
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3、NDRG4
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4、NDRG4
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5、NDRG4
‑
7中的至少任一。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述甲基化标志物为SDC2
‑
1、SDC2
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2、SDC2
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4、NDRG4
‑
1、NDRG4
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2、NDRG4
‑
3、NDRG4
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4、NDRG4
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5和NDRG4
‑
7的组合。3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：甲基化标志物的引物和探针为：SDC2_1_F CAACAAGTGAGAGGGTGCTGTSDC2_1_R GGGCTCAGGGGCACTCASDC2_1_P CAGCTGTGGGTGGTGGGAGCAGSDC2_2_F GGGCTTGGGGGTGCTTSDC2_2_R ACCAACAAGTGAGAGGGCASDC2_2_P CCAGGGCACAGCTGCAGGCSDC2_4_F CCTCCTGCCCAGTGCTTSDC2_4_R CCAAGCCTGAGCCACAATCASDC2_4_P CAGATTCATGTGCACAGGCTGCACNDRG4_1_F GTGCAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨政权，丁春明，宋梦慧，金胜男，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：