一种磺胺二甲嘧啶降解菌剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及环保领域。一种磺胺二甲氧嘧啶混合菌剂，包括原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae）和不动杆菌（Acinetobacter sp.）。本发明专利技术的磺胺二甲氧嘧啶混合菌剂源于畜禽粪便，与粪便堆肥原生微生物菌群兼容性良好。好。

【技术实现步骤摘要】
protophormiae)、不动杆菌(Acinetobactersp.)、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)和微杆菌(Microbacteriummitrae)组成，均从畜禽粪便中驯化、筛选得到；混合菌剂由各菌种等比例混合组成。
[0009]磺胺二甲氧嘧啶混合菌剂的驯化和筛选方法，包括以下步骤：
[0010]1)称取冷藏猪粪样品50g于1L的三角瓶中，加入450ml无菌水(粪便：水＝1:9，v:v)，180rpm，室温振荡2小时，滤纸过滤获得猪粪废水悬液1，121℃灭菌30min。
[0011]2)取冷藏猪粪按照1:1与水混合(100g+100ml)，180rpm，室温振荡2小时，静置2小时，取上清，获得猪粪悬浊液2。
[0012]3)取49ml高温灭菌处理的猪粪废水悬液1，加磺胺二甲嘧啶至终浓度10mg/L，并加1ml猪粪悬浊液2，在25℃，180rpm，避光震荡培养。
[0013]4)培养结束后，取100μl培养物涂布到含有磺胺二甲嘧啶的LB平板上，随机挑取单菌落到含有10mg/L磺胺二甲嘧啶的LB培养基中，培养5天，测定抗生素降解率。
[0014]5)选取可降解抗生素的菌种，提取细菌总DNA，用16SrDNA通用引物进行PCR扩增后，进行测序、同源性比对，确定降解菌的种属。
[0015]6)挑选筛选获得的磺胺二甲嘧啶降解菌，制定不同菌剂组合方案；将菌剂组合按照1％接种到猪粪废水悬液中，加磺胺二甲嘧啶至终浓度10mg/L，在180rpm，25℃，避光震荡培养；培养2、5天后，测定磺胺二甲嘧啶降解率；通过对比磺胺二甲嘧啶降解率，获得最优的菌剂组合方案。
[0016]与现有技术对比，本专利技术的有益效果是：
[0017]1)本专利技术的原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)、不动杆菌(Acinetobactersp.)、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)和微杆菌(Microbacteriummitrae)来源于畜禽粪便，与粪便堆肥原生微生物菌群兼容性良好。相对于制药厂生化处理池污泥等其它来源的混合菌剂应用粪污、粪便废水的处理，可能面临环境兼容性差，适应不良而导致无法较好执行降解功能的情况。
[0018]2)本专利技术的菌株中Arthrobacterprotophormiae(原玻璃蝇节杆菌)、Acinetobactersp.的磺胺类抗生素降解性能未有报道，为抗生素污染修复提供了新的微生物菌种资源。
[0019]3)在菌剂互配过程中，将所有来源于粪便的抗生素降解菌混合制备而成的复合菌剂对粪污中磺胺二甲嘧啶的去除效果不佳，仅为17.7％；在未优化下，原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)和不动杆菌(Acinetobactersp.)对原始猪粪废水中磺胺二甲嘧啶降解率为11.3％和13.9％。但经过优化后，相同条件下，复合菌剂对粪污中磺胺二甲嘧啶的去除率可提高至60％。与不添加菌剂的对照相比，接种该菌剂的畜禽粪污中磺胺二甲嘧啶去除效率从20％～35％提高至43％～60％。
具体实施方式
[0020]下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述。
[0021]实施例：
[0022]一、磺胺二甲嘧啶降解菌种驯化、筛选和鉴定试验
[0023]1、试验流程
[0024]1)称取冷藏猪粪样品50g于1L的三角瓶中，加入450ml无菌水(粪便：水＝1:9，v:v)，180rpm，室温振荡2小时，滤纸过滤获得猪粪废水悬液1，121℃灭菌30min。
[0025]2)取冷藏猪粪按照1:1与水混合(100g+100ml)，180rpm，室温振荡2小时，静置2小时，取上清，获得猪粪悬浊液2。
[0026]3)取49ml高温灭菌处理的猪粪废水悬液1，加磺胺二甲嘧啶至终浓度10mg/L，并加1ml未灭菌猪粪悬浊液2，在25℃，180rpm，避光震荡培养。
[0027]4)在培养2天时采样，测定磺胺二甲嘧啶残留浓度。计算磺胺二甲嘧啶降解率。
[0028]5)取100μl猪粪处理培养物(2天)，涂布到含有磺胺二甲嘧啶的LB平板上，培养36
‑
38小时；
[0029]6)从耐药LB平板上，随机挑取11株单菌落到含有10mg/L磺胺二甲嘧啶的LB培养基中，培养5天，测定抗生素降解率，降解率如表1。
[0030]7)选取可降解抗生素的菌种，提取细菌总DNA，用16SrDNA通用引物进行PCR扩增后，进行测序、同源性比对，结合生理生化、菌种形态，确定降解菌的种属。
[0031]2、试验结果
[0032]从2天的磺胺二甲嘧啶降解率上看，猪粪提取液中存在能够降解磺胺二甲嘧啶的菌群，2天降解率29.6％。进一步从培养物中，我们筛选到了11株磺胺二甲嘧啶耐受细菌并进行了鉴定，分别是原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)、不动杆菌(Acinetobactersp.)、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)、微杆菌(Microbacteriummitrae)、嗜冷芽孢杆菌(Psychrobacillussp.)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)、库尔特氏杆菌(Kurthiapopuli)、神户肠杆菌(Enterobacterkobei)、食丁酸芽孢杆菌(Peribacillusbutanolivorans)、洛菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)。其中，原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)、不动杆菌(Acinetobactersp.)磺胺二甲嘧啶降解性能高于其他菌种。
[0033]表1磺胺二甲嘧啶降解菌鉴定结果和磺胺二甲嘧啶降解效率％
[0034]菌种SMZ降解率(％)Arthrobacter protophormiae13.90Lysinibacillus fusiformis7.80Microbacterium mitrae4.90Psychrobacillus sp.5.91Bacillus cereus5.67Bacillus thuringiensis7.74Kurthia populi10.80Enterobacter kobei5.78Peribacillus butanolivorans5.85Acinetobacter sp.11.25Acinetobacter lwoffii0
[0035]Arthrobacterprotophormiae即保藏编号为CGMCCNo.25224的原玻璃蝇节杆Arthrobacterprotophormiae4
‑
11；Acinetobactersp.即保藏编号为CGMCCNo.25224的
Acinetobacter sp.S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磺胺二甲氧嘧啶混合菌剂，其特征在于，包括原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae）和不动杆菌（Acinetobacter sp.）；原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacterprotophormiae）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25224；不动杆菌（Acinetobacter sp.）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25225。2.根据权利要求1所述的磺胺二甲氧嘧啶混合菌剂，其特征在于由原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）和微杆菌（Microbacterium mitrae）组成。3.根据权利要求1所述的磺胺二甲氧嘧啶混合菌剂，其特征在于原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）和微杆菌（Microbacterium mitrae）从畜禽粪便中驯化、筛选得到。4.根据权利要求2所述的磺胺二甲氧嘧啶混合菌剂，其特征在于，原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）和微杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：林辉，张锦，成琪璐，马军伟，俞巧钢，孙万春，叶静，王强，邹平，陈照明，马进川，王峰，刘洋之，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：