UPLC-MS/MS法同时测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种UPLC

【技术实现步骤摘要】
UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物浓度的方法


[0001]本专利技术涉及一种检测人尿液中药物浓度的方法，具体涉及一种 UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物 LBQ657浓度的方法。

技术介绍

[0002]我国高血压合并慢性肾脏病(CKD)降压现状不容乐观，超过50％的患者联合使用降压药，但血压达标率仅15％。心脑血管疾病是透析患者死亡的首位原因，透析患者合并心衰的比例高达45％以上，但是透析合并心衰的患者生存率显著下降，危害加剧。
[0003]沙库巴曲/缬沙坦(LCZ696，商品名诺欣妥)是一种双重的血管紧张素受体拮抗剂(ARB)和脑啡肽酶抑制剂(NEPi)，一种由沙库巴曲和缬沙坦以1:1摩尔比形成的钠盐复合物。研究表明LCZ696在慢性肾脏病患者中的降压效果、心血管及肾脏中的保护作用。LCZ696经口服后，沙库巴曲和缬沙坦迅速被吸收并分解为沙库巴曲和缬沙坦，沙库巴曲迅速转化为LBQ657(NEPi的活性代谢物)，且沙库巴曲和缬沙坦主要通过肾脏途径排泄。但是研究的病人肾小球滤过率均大于30ml/min/1.73m2。目前尚无LCZ696在终末期肾衰病人的尿液药代动力学的研究。以及沙库巴曲和缬沙坦在健康人尿液中的回收率已有报道，在经腹膜透析的终末期肾病患者尿液中的回收率尚不清楚。
[0004]现有Jimmy Flarakos等发表[Disposition and metabolism of[(14)C] Sacubitril/Valsartan(formerly LCZ696)an angiotensin receptor neprilysininhibitor,in healthy subjects(文献1)]发现13％的缬沙坦，0.8～2.8％的沙库巴曲，52～68％的LBQ657通过尿液排泄，本专利方法的用途为慢性肾病终末期的患者，其特点一是有无残存肾功能导致三个化合物的排泄差异大，加上病人个体间的尿液排泄量差异也大，导致三个化合物的线性范围难以预测；二是三个化合物的线性范围差异相比于健康人来说进一步加大，因为肾功能不全患者不影响缬沙坦以及沙库巴曲的AUC，但是LBQ657的半衰期从健康人的12小时分别延长到38.5小时，AUC提高了2.70倍，可能出现缬沙坦和沙库巴曲的LLOQ的信噪比低，而LBQ657的灵敏度已经饱和(进样相同的量，其中缬沙坦的响应比沙库巴曲低了5倍，比LBQ657的低了2倍)的情况，这对于同时测定三个化合物的难度进一步加大；三是缬沙坦、沙库巴曲和 LBQ657能够与尿液蛋白高度结合，结合率为94％～97％，终末期肾衰患者易出现蛋白尿，导致尿液中游离药物的浓度更低，更进一步对灵敏度提出了更高的需求。
[0005]Surya P.Ayalasomayajula等发表的文章[Effect of renal function on thepharmacokinetics of LCZ696(sacubitril/valsartan),an angiotensin receptorneprilysin inhibitor，(文献2)]采用了HPLC
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MS/MS法测定了尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657的浓度，其给药方案是给药400mg，每天一次，线性范围均为10～10000ng/mL。该文献给药剂量比慢性肾病终末期的推荐剂量(50 mg)高了8倍，并且SuryaP.Ayalasomayajula等也发现缬沙坦以及沙库巴曲的稳态Cmax与肾功能无关，故该文献的定量下限并不能满足需
求。而且该文献采用了HPLC
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MS/MS法，由于使用色谱柱进行分离耗费时间较长、灵敏度较低，并不适用于快速、高通量的生物样品分析。另外，UPLC
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MS/MS应用梯度洗脱时极容易残留，冯仕银等人发表的文章[LC
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MS/MS法测定人血浆及尿液中缬沙坦的浓度及其药动学研究(文献3)]采用了LC
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MS/MS法,但并没有解决残留问题，并且残留物主要是残留在进样阀，为了解决残留，对流动相性质及其起始比例，洗针液及其洗针程序，进样阀的转动等提出了更高要求。
[0006]CN110031568A(文献4)使用的内标缬沙坦
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d3，内标与待测物只相差3 个质量数，彼此之间的干扰大；Levi等人发表的文章[Direct analysis ofvalsartan or candesartan in human plasma and urines by on
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line solid phaseextraction coupled to electrospray tandem mass spectrometry(文献5)]采用了在线固相萃取法测量尿液中缬沙坦的浓度，样品无需人工处理但是试剂消耗多，批间的重复性难以保证。冯仕银等发表的[LC
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MS/MS法测定人血浆及尿液中缬沙坦的浓度及其药动学研究(文献6)]采用乙腈蛋白沉淀法，并采用 HPLC
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MS/MS检测人尿液样品中的缬沙坦，进样量为15μL。该方法虽然采用蛋白沉淀法，但是并未对处理后的样品进行稀释，并且进样量比较大，后续一方面会对色谱柱造成较大破坏，也会因为样品中的杂质较多对液相系统和质谱造成堵塞。以及Javed ShaikhAfzal Shaikh等发表的[High performanceliquid chromatographic assay of amlodipine,valsartan and hydrochlorothiazidesimultaneously and its application to pharmaceuticals,urine and plasma analysis (文献7)]采用高效液相色谱
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紫外检测器，但该分析方法的线性范围窄，紫外检测器专属性差，仅用于测定特定时间段多种药物联合用药时的缬沙坦浓度。
[0007]因此，目前已有的检测人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657浓度的方法并不适用于慢性肾衰患者临床药代动力学研究的样本检测。本领域急需能够用于检测慢性肾病终末期患者尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657的浓度的快速灵敏的方法，同时还需解决残留问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，解决了不能快速灵敏地同时检测慢性肾病终末期患者尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657浓度的问题。本专利技术应用了梯度洗脱的方式，并解决了化合物的残留，而且进样量比较少大大降低对仪器的污染。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，该方法针对的是慢性肾病终末期患者尿液样品；该方法包含：采用乙腈蛋白沉淀法对样品进行前处理，样品前处理后采用等体积的稀释剂进行稀释，其中所述稀释剂为50％乙腈
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0.1％甲酸水；采用超高效液相色谱串联质谱对稀释后的样品进行检测：温度：40℃，流动相：A相0.1％甲酸水溶液，B相是体积比为50:50:0.2的甲醇
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乙腈
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甲酸，洗脱方式：梯度洗脱；其中，梯度洗脱条件设置为：0min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量65％；1.50min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量80％；2.00min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量98％；2.60min时，流动相流速为0.3mL/min，冲洗自动进样器高压阀；2.61～3.00min时，流动相流速为0.6mL/min，流动相中的B相含量98％；3.01min时，流动相流速为0.6mL/min，流动相中的B相含量65％；3.51min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量65％；4.00min时，流动相流速为0.3mL/min，停止进样。2.根据权利要求1所述的UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱串联质谱中，高效液相色谱仪是岛津LC
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30AD超高效液相色谱，质谱仪是日本岛津公司8060型串联质谱仪。3.根据权利要求2所述的UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C
18
，规格为2.1mm
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50mm，1.7μm。4.根据权利要求2所述的UPLC
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MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱仪，配有...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振磊，郑莉，金瑛，邸相杰，崔冬瀚，齐小慧，付丽莎，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：