一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法技术

本发明专利技术是一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)将2

【技术实现步骤摘要】
一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法


[0001]本专利技术涉及低聚糖检测的领域，特别涉及一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法。

技术介绍

[0002]低聚糖是哺乳动物乳中重要的一类生物活性成分，具有维持肠道微生态平衡、调节机体免疫、抵御致病菌感染等功能。不同哺乳动物来源的低聚糖均显示出潜在的生物活性价值，可作为食品组分添加到医疗或功能性食品中。哺乳动物乳是自然界低聚糖的主要来源，因此对哺乳动物乳中的低聚糖进行检测，是大规模提取低聚糖进而开发新型医疗或功能性食品的必要前提。
[0003]目前对母乳中低聚糖的检测报道较多，测定方法主要有液质联用(Porfirio et al.,2020)、高效阴离子交换色谱(Landberg,Lundblad,&1998)、高效液相色谱(McGuire et al.,2017)。其中液质联用使用不同离子源或分离技术与飞行时间质谱(TOF
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MS)结合是目前检测到乳中低聚糖种类最多的一种检测技术，可定性检测多达200多种母乳中的低聚糖(Wu,Grimm,German,&Lebrilla,2011；Wu,Tao,German,Grimm,&Lebrilla,2010)。基质辅助激光解吸(MALDI)离子源与TOF
‑
MS联用是目前最常用的母乳低聚糖测定法。
[0004]专利申请202011360676.3公开的一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。
[0005]高效阴离子交换色谱和高效液相色谱法对低聚糖同分异构体检测效果较差，可测定的低聚糖范围较窄。TOF
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MS尽管可检测到数量较多的低聚糖，但该技术的预处理通常需要采用不同前处理手段对乳中的中性和酸性低聚糖分别进行处理，分析过程中也需在不同的离子模式下对中性和酸性低聚糖分别进行检测，因此前处理及分析过程步骤繁琐。并且，TOF
‑
MS无法对同分异构体进行区分(van Leeuwen,2019)，其对乳中低聚糖的检测还依赖于色谱分离技术，在同分异构体无法被完全分离的情况下不能进行准确定性及定量测定。同时，由于其他哺乳动物乳中低聚糖含量低于母乳中的含量，因此当下的报道中适用于检测母乳低聚糖的测定方法未必适用于检测其他哺乳动物乳中的低聚糖。目前未有涉及采用一种检测方法测定多种哺乳动物乳中低聚糖方法的报道。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术的首要目的是提供一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，该方法采用HPLC
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QqQ
‑
MS联用，对不同哺乳动物乳中的低聚糖进行测定，简化了前处理以及分析过程，克服现有处理及分析过程步骤繁琐的缺陷。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，本专利技术的检测方法结果准确、稳定、可靠。
[0008]申请人研究发现，三重四极杆质谱(QqQ
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MS)应用多反应监测技术(MRM)对目标物质进行确定，低聚糖的同分异构体在无法被完全分离的情况下也可以被QqQ
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MS测定，并且QqQ
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MS对低聚糖的检测只需在一种离子模式下进行，相比TOF
‑
MS简化了前处理以及分析过程。同时，QqQ
‑
MS具有较高分辨率及灵敏度，检测下限可达到ppb浓度水平，可适用于不同哺乳动物乳中低聚糖含量测定。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0010]一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，包括前处理、液相(HPLC)及QqQ
‑
MS操作步骤：
[0011](1)将2
‑
5mL乳在4℃下以4000
‑
6000rpm的速度离心20
‑
30min，去除上层脂肪；
[0012](2)取(1)中下清液加入4
‑
5倍体积Folch溶液，混合均匀，在4℃下以4000
‑
6000rpm的速度离心20
‑
30min，进一步去除脂肪；
[0013](3)取(2)中上清液，加入2
‑
4倍体积乙醇，混合均匀，于
‑
80℃放置2
‑
4h，在室温解冻后，于4℃下以4000
‑
6000rpm的速度离心20
‑
30min，去除蛋白质；
[0014](4)收集(3)中上清液，在35
‑
40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干；
[0015](5)将冻干固体溶于2
‑
5mL去离子水中，取0.5
‑
1mL水溶液与0.5
‑
1mL2M NaBH4混合均匀，置于65℃反应2h；
[0016](6)反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，在35
‑
40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的水溶液冻干，得到还原后的低聚糖固体。
[0017](7)将(6)中得到的低聚糖固体重新溶于0.5
‑
1mL超纯水中，用0.05M NaCl溶液稀释至2
‑
5mL，加入0.2
‑
0.5mL 2ppm的棉子糖作为内标，过0.22m滤膜后上样HPLC
‑
QqQ
‑
MS进行分析，其中，HPLC
‑
QqQ
‑
MS的色谱柱为多孔石墨碳柱。
[0018]进一步地，步骤(6)中，所述的反应后混合液纯化为采用石墨化碳固相萃取进行纯化，具体操作步骤为：
[0019]1)石墨化碳固相萃取小柱经6mL超纯水洗涤后，用6mL含0.05％(v/v)TFA的乙腈溶液(80％，v/v)活化小柱，再经6mL超纯水洗涤，去除有机溶剂；
[0020]2)将步骤(5)中反应后的混合溶液上样到1)中活化并洗涤后的小柱中，用20mL超纯水洗涤去除盐分；
[0021]3)用6mL 20％(v/v)乙腈溶液洗脱，收集洗脱液；
[0022]4)用6mL含有0.05％(v/v)TFA的乙腈溶液(20％，v/v)洗脱，收集洗脱液。
[0023]进一步地，步骤(7)中，所述的HPLC
‑
QqQ
‑
MS分析为采用HPLC进行分离，具体参数为：
[0024]1)采用Hypercarb色谱分离柱进行分离，柱温为40℃；
[0025]2)采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.1％(v/v)氨水的乙酸铵(10mM)溶液，流动相B为含有0.1％(v/v)氨水的乙腈；
[0026]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于方法包括如下步骤：(1)将2
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5mL乳在4℃下以4000
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6000rpm的速度离心20
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30min，去除上层脂肪；(2)取(1)中下清液加入4
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5倍体积Folch溶液，混合均匀，在4℃下以4000
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6000rpm的速度离心20
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30min，进一步去除脂肪；(3)取(2)中上清液，加入2
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4倍体积乙醇，混合均匀，于
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80℃放置2
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4h，在室温解冻后，于4℃下以4000
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6000rpm的速度离心20
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30min，去除蛋白质；(4)收集(3)中上清液，在35
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40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干；(5)将冻干固体溶于2
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5mL去离子水中，取0.5
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1mL水溶液与0.5
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1mL2M NaBH4混合均匀，置于65℃反应2h；(6)反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，在35
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40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的水溶液冻干，得到还原后的低聚糖固体；(7)将(6)中得到的低聚糖固体重新溶于0.5
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1mL超纯水中，用0.05M NaCl溶液稀释至2
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5mL，加入0.2
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0.5mL 2ppm的棉子糖作为内标，过0.22m滤膜后上样HPLC
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QqQ
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MS进行分析，其中，HPLC
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QqQ
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MS的色谱柱为多孔石墨碳柱。2.根据权利要求1所述的哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于步骤(6)中，所述的反应后混合液纯化为采用石墨化碳固相萃取进行纯化，具体操作步骤为：1)石墨化碳固相萃取小柱经6mL超纯水洗涤后，用6mL含0.05％(v/v)TFA的乙腈溶液(80％，v/v)活化小柱，再经6mL超纯水洗涤，去除有机溶剂；2)将步骤(5)中反应后的混合溶液上样到1)中活化并洗涤后的小柱中，用20mL超纯水洗涤去除盐分；3)用6mL 20％(v/v)乙腈溶液洗脱，收集洗脱液；4)用6mL含有0.05％(v/v)TFA的乙腈溶液(20％，v/v)洗脱，收集洗脱液。3.根据权利要求1所述的哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于步骤(7)中，所述的HPLC
‑
QqQ
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MS分析为采用HPLC进行分离，具体参数为：1)采用Hypercarb色谱分离柱进行分离，柱温为40℃；2)采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.1％(v/v)氨水的乙酸铵(10mM)溶液，流动相B为含有0.1％(v/v)氨水的乙腈；3)流动相A与流动相B的具体梯度洗脱为：第0
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3分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10
‑
0.15mL/min；第3
‑
4分钟，流动相A为99
‑
95％，流动相B为1
‑
5％，流速为0.15mL/min；第4
‑
20分钟，流动相A为95
‑
83％，流动相B为5
‑
17％，流速为0.15mL/min；第20
‑
30分钟，流动相A为83
‑
58％，流动相B为17
‑
42％，流速为0.15mL/min；第30
‑
35分钟，流动相A为58
‑
10％，流动相B为42
‑
90％，流速为0.15mL/min；第35
‑
50分钟，流动相A为10％，流动相B为90％，流速为0.15mL/min；第50
‑
51分钟，流动相A为10
‑
99％，流动相B为90
‑
1％，流速为0.15
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋昂芯，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：