荧光标记的核苷酸类似物及基因测序芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种荧光标记的核苷酸类似物及基因测序芯片，所述核苷酸类似物上具有荧光分子，具有如结构通式（1）所示结构：其中，B为碱基；L为连接基团；n1、n2、n3、n4为不小于0的整数，且n1、n2、n3、n4不同时为零；R1、R2、R3、R4选自荧光分子、氢、官能团或碳链，且至少一个为荧光分子。所述基因测序芯片为可分离式结构，在反应层结构中设有反应孔，荧光标记的核苷酸类似物置于反应孔内。本发明专利技术所提供的荧光标记的核苷酸类似物可以通过多种标记方法来实现基因测序，从而提高了基因测序方法的多样性，可以实现与多种类型的用于收集、分析荧光信号的荧光信号收集装置相匹配，还可以降低基因测序的错误率。错误率。错误率。

【技术实现步骤摘要】
荧光标记的核苷酸类似物及基因测序芯片


[0001]本专利技术属于生物
，特别是涉及荧光标记的核苷酸类似物及基因测序芯片。

技术介绍

[0002]单分子实时测序技术（SMRT）芯片是一种带有很多零模式波导孔（ZMW）的金属片，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时监测插入碱基的荧光信号。测序时将DNA样品打断成许多小的片段，分散到不同的ZMW纳米孔中。对用于测定DNA样品链的核苷酸结构进行荧光标记，当ZMW孔底部聚合反应发生时，参与反应的核苷酸结构会在小孔的荧光探测区域中被DNA聚合酶滞留数十毫秒，荧光标记在激光束的激发下发出荧光，反应完成后荧光标记被聚合酶切除而弥散出ZMW小孔。根据收集到的荧光信号判定参与聚合反应的核苷酸结构种类。
[0003]天然的核苷酸或合成的核苷酸类似物是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。核苷酸是合成生物大分子核糖核酸（RNA）及脱氧核糖核酸（DNA）的前身物。
[0004]在基因测序中，需要对核苷酸结构进行荧光标记，现有研究主要采用在核苷酸的戊糖基团上进行荧光分子的取代或者在磷酸酯链末端的羟基上进行荧光分子的取代。以上方法只能在核苷酸结构上添加一个荧光分子，因此，在聚合反应中可能会导致一定的测序错误率，而且，现有的荧光标记的核苷酸结构只能采用不同的荧光分子来识别不同的碱基身份，存在标记方法单一的问题。

技术实现思路

[0005]为了解决上述全部或部分问题，本专利技术的目的在于：提供一种荧光标记的核苷酸类似物及基因测序芯片，所提供的荧光标记的核苷酸类似物可以通过多种标记方法来实现基因测序，从而提高了基因测序方法的多样性，可以实现与多种类型的用于收集、分析荧光信号的荧光信号收集装置相匹配，而且，还可以降低基因测序的错误率。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种荧光标记的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物上具有荧光分子，具有如下通式（1）所示结构：通式（1）；其中，B为碱基；L为连接基团；
n1、n2、n3、n4为不小于0的整数，且n1、n2、n3、n4不同时为零；R1、R2、R3、R4选自荧光分子、氢、官能团或碳链，且至少一个为荧光分子。
[0007]L可以选自羰基、硫代连接基团和烷烃链等，其中，烷烃链例如
‑
(CH2)
m
‑
，m为大于或等于1的整数。当R1、R2、R3、R4可以直接连接在亚磷酸酯基团上时，L也可以是R1、R2、R3、R4上能够直接与亚磷酸酯基团相连的部分。
[0008]本专利技术所提供的荧光标记的核苷酸类似物可以进行多种类型的荧光标记，多种荧光标记类型的核苷酸类似物可以匹配多种类型的荧光信号收集装置，在一个核苷酸类似物结构上可以存在多种发射波段的荧光分子或多种荧光强度的荧光分子，因此，可以降低基因测序的错误率。
[0009]所述n1、n2、n3、n4优选为0
‑
9中的任一整数，且n1、n2、n3、n4不同时为零。亚磷酸酯链过长将会影响到DNA聚合反应，可能导致DNA聚合反应出错，还可能会影响到荧光分子的切除，从而影响测序结果，导致测序失败。
[0010]所述n1为不小于1的整数，n2=n3=n4=0，具有如下通式（2）所示结构：通式（2）；其中，B为碱基；L为连接基团；n=n1，R=R1；R为荧光分子。
[0011]L可以选自羰基、硫代连接基团和烷烃链等，其中，烷烃链例如
‑
(CH2)
m
‑
，m为大于或等于1的整数。当R1、R2、R3、R4可以直接连接在亚磷酸酯基团上时，L也可以是R1、R2、R3、R4上能够直接与亚磷酸酯基团相连的部分。
[0012]所述n1优选为大于等于1、小于等于9的整数，n2=n3=n4=0。同样地，亚磷酸酯链过长将会影响到DNA聚合反应，可能导致DNA聚合反应出错，还可能会影响到荧光分子的切除，从而影响测序结果，导致测序失败。
[0013]当n2=n3=n4=0时，同一碱基标记的核苷酸类似物结构仅存在一种荧光分子。在此种情况下，不同碱基上的荧光标记类型存在两种情况：第一种是不同碱基的荧光分子的种类不同，且发射波段不同；第二种是不同碱基的荧光分子的发射波段相同或相似、碱基上荧光分子的总荧光强度相互不同。第二种情况还可以分为：1、不同碱基的荧光分子种类均相同，不同碱基上的荧光分子数量不同。2、不同碱基的荧光分子种类不同，如果不同种类荧光分子具有相同或相似的荧光强度，则需要满足不同碱基上的荧光分子数量不同；如果不同种类荧光分子的荧光强度相差较大，则需要控制不同碱基上的荧光分子数量，使得不同碱基上的荧光分子的总荧光强度相互不同。
[0014]不同碱基标记的荧光分子的发射波段相同或相似，且不同碱基中荧光分子的荧光
强度不同。荧光分子的发射波段相同或相似，在荧光信号收集时，不同碱基对应的荧光信号出现在同一波段，而不同碱基中荧光分子的荧光强度不同会导致出现的荧光信号强度不同，从而可以区分来源于不同碱基的荧光信号，实现基因测序。
[0015]不同碱基标记的荧光分子种类相同，且不同碱基中荧光分子的数量不同。在需要确保不同碱基对应的荧光分子的发射波段相同或相似时，最简单的是在不同碱基中采用相同种类的荧光分子，在这种情况下，为实现不同碱基中荧光分子的荧光强度不同，将不同碱基中的荧光分子设计成不同数量。此种方法的原理简单、且操作方便，非常适用于通过对荧光强度进行区别来识别不同碱基的身份信息，可以与通过检测信号强度来进行基因测序的荧光信号收集分析装置相匹配。
[0016]不同碱基标记的荧光分子的发射波段不同。可以避免在荧光信号收集与分析时出现信号波段之间的干涉，可以使得检测到的荧光信号准确清楚。通过检测荧光信号的波段，来区分不同碱基的身份信息，以实现基因测序。优选地，不同碱基对应的荧光分子可以选自发射波段相差较大的荧光分子，方便清楚地区分不同碱基的荧光信号。
[0017]同一碱基中存在两个以上荧光分子，且同一碱基中所有荧光分子的种类相同。同一碱基中的荧光分子可以有一种或多种，当同一碱基中的荧光分子只有一种时，只需要确保不同碱基中的荧光分子发射波段不同即可，可以简化荧光分子的标记过程。大部分情况下，在同一碱基中采用的荧光分子只有一种。
[0018]所述荧光分子可以选自市场上常用的荧光分子，如Alexa fluor系列染料分子、青色素染料分子、异硫氰酸荧光素、罗丹明或5
‑
羧基荧光素等。
[0019]所述B代表的碱基选自腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C、胸腺嘧啶T或尿嘧啶U。对DNA进行测序时，选用的碱基为腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T；对RNA进行测序时，选用的碱基为嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C和尿嘧啶U。
[0020]所述荧光标记的核苷酸类似物可以作为DNA聚合酶底物或RNA聚合酶底物，被DNA聚合酶或RNA聚合酶识别并掺入到DNA链或RNA链中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光标记的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物上具有荧光分子，其特征在于，具有如下通式（1）所示结构：通式（1）；其中，B为碱基；L为连接基团；n1、n2、n3、n4为不小于0的整数，且n1、n2、n3、n4不同时为零；R1、R2、R3、R4选自荧光分子、氢、官能团或碳链，且至少一个为荧光分子。2.根据权利要求1所述的荧光标记的核苷酸类似物，其特征在于，所述n1为不小于1的整数，n2=n3=n4=0，具有如下通式（2）所示结构：通式（2）；其中，B为碱基；L为连接基团；n=n1，R=R1；R为荧光分子。3.根据权利要求1或2所述的荧光标记的核苷酸类似物，其特征在于，不同碱基标记的荧光分子的发射波段相同或相似，且不同碱基中荧光分子的荧光强度不同。4.根据权利要求3所述的荧光标记的核苷酸类似物，其特征在于，不同碱基标记的荧光分子种类相同，且不同碱基中荧光分子的数量不同。5.根据权利要求1或2所述的荧光标记的核苷酸类似物，其特征在于，不同碱基标记的荧光分子的发射波段不同。6.根据权利要求5所述的荧光标记的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：上海近观科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：