本发明专利技术公开了一种能够针对软米水稻低直链淀粉含量调控基因ACF1进行筛选的分子标记及扩增ACF1基因分子标记的引物及检测方法。检测方法为：(1)提取水稻总DNA作为模板，加入上述引物进行PCR扩增；(2)取PCR产物进行限制性核酸内切酶MaeII消化；(3)酶切产物凝胶电泳检测。本发明专利技术可直接对水稻低直链淀粉含量调控基因ACF1进行检测，为快速有效地实现培育优质软米水稻新品种奠定基础。米水稻新品种奠定基础。米水稻新品种奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
水稻直链淀粉含量基因ACF1等位基因的分子标记及其检测的引物和方法
[0001]本专利技术涉遗传学和植物育种领域，具体为一种筛选低直链淀粉含量基因ACF1等位基因型水稻的分子标记、扩增或检测分子标记的引物以及检测方法，用于辅助常规育种快速、简便、准确选育低直链淀粉含量水稻。
技术介绍
[0002]水稻是最重要的粮食作物之一，提高产量和品质一直是水稻遗传育种的两个关键目标。过去几十年，由于杂交稻的推广以及水稻栽培和管理技术水平的提高，水稻产量已得到极大提升，而稻米品质改良却远远落后(Zeng et al.,2017，Plant Molecular Biology,65:501
‑
509； Zhao et al.,2017，Indian Journal of Genetics and Plant Breeding,77,221)。同时，随着人们生活水平的提高，人们对稻米品质的要求也越来越高。因此提高稻米品质成为育种家和消费者首要考虑的因素。稻米品质主要包括碾米品质、外观品质、营养品质和食味品质，其中食味品质是稻米品质的核心(Tian et al.,2009,Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,106(51):21760
‑
21765)。
[0003]淀粉是稻米的主要成分，约占精米干重的90％左右，由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉与总淀粉的比值，也称为直链淀粉含量 (Amylose Content，AC)，是决定稻米食味品质的最重要因素(Tianet al.,2009,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,106(51):21760
‑
21765)。由于较低直链淀粉含量的软米食味品质好，甜润爽口，冷热饭均蓬松，质软，冷后不回生。软米的价格普遍高于非软米香水稻品种。随着人们生活水平的提高，目前市场对软米香米的需求量日益增加。这些都极大地促进了人们对水稻软米香型特性的遗传研究，同时也加快了软米香稻新品种的选育进程。
[0004]水稻GBSS I是稻米直链淀粉合成的关键酶，由6号染色体上的 Wx基因编码。在自然界中，Wx至少存在10种不同等位基因型，包括Wx
a
、Wx
b
、Wx
mq
、Wx
hp
、Wx
mp
、Wx
op
、Wx
in
、Wx
lv
、Wx
mw
和wx，具有不同基因型的稻米直链淀粉含量不同(Zhang et al；2019, Molecular Plants 12,1157
‑
1166；Zhang et al；2020,Journal of IntegrativePlant Biology.63:889
‑
901)。其中Wx
mq
基因型水稻直链淀粉较低，已被广泛用于优质软米水稻培育。然而目前用于优质水稻培育的直链淀粉含量相关基因只有Wx基因被报道。本研究组前期从优质软米水稻“银香38”品种中克隆了一个新的控制直链淀粉含量的基因ACF1,其编码一个新的C2H2锌指蛋白(CN113637688A，公开日)。
[0005]软米水稻的产量通常较低，需要与其他水稻杂交获得产量更高的品种。一般都选择产量较高的非软米水稻与软米水稻进行杂交，然后再将杂交F1植株与高产的非软米水稻回交几代。过去在较低直链淀粉含量软米传统育种过程中，育种者主要通过直链淀粉含量测定来区分软米水稻和非软米水稻。但该方法费时且检测费用非常昂贵。随着各种分子标
记的发展，许多重要农艺性状和品质性状的分子标记被开发用于水稻育种。
[0006]因此，需要提供一种分子标记、相应的引物和检测方法来辅助培育和筛选粳米水稻中的软米水稻和非软米水稻。
技术实现思路
[0007]本专利技术提供了一种筛选水稻直链淀粉含量基因ACF1等位基因型的分子标记dCAPS(MaeII)以及检测该分子标记的引物及方法，能够快速并准确地鉴定ACF1基因不同等位基因型。可用来辅助培育筛选软米水稻。
[0008]经过基因序列分析发现，相比于“日本晴”水稻，“银香38”软米水稻ACF1在编码区655bp处存在一个G
‑
A的突变，该突变导致“银香 38”大米具有低直链淀粉含量的特性，即ACF1编码区655bp处G
‑
A 变异与低直链淀粉含量呈对应关系。即ACF1
655A
等位基因型粳稻稻米直链淀粉含量较低，为软米水稻，而ACF1
655G
等位基因型水稻直链淀粉含量相对较高，为非软米水稻。
[0009]本专利技术的技术方案：
[0010]一种水稻低直链淀粉含量基因ACF1的分子标记(以下简称 dCAPS(MaeII))，在软米水稻中，其ACF1基因编码区655bp
‑
658bp 处为ACGT；非软米水稻中，ACF1基因编码区655bp
‑
658bp处为 GCGT。
[0011]分子标记dCAPS(MaeII)位于直链淀粉含量基因ACF1编码区 655bp
‑
658bp处。在低直链淀粉含量的软米水稻中，该位点的4个核苷酸序列“ACGT”能够被限制性核酸内切酶MaeII识别并剪切，而中直链淀粉含量普通粳稻C2H2锌指蛋白基因ACF1
655G
编码区655bp
‑ꢀ
655bp处的核苷酸序列为“GCGT”，不能被限制性核酸内切酶MaeII识别并剪切，由此可以快速和准确地区分软米粳稻和非软米粳稻品种中的ACF1
655A
基因型和ACF1
655G
基因型。
[0012]用于扩增和检测上述新的分子标记dCAPS(MaeII)或者扩增和检测水稻直链淀粉含量基因ACF1等位基因的引物，其核苷酸序列包括 SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。更优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
[0013]SEQ ID No.1：5
’‑
GAATCTCGACGGGTTCAAGT
‑3’
[0014]SEQ ID No.2：5
’‑
TCTTATTGTCTGCTCTGACATGG
‑3’
[0015]检测水稻直链淀粉含量基因ACF1等位基因的方法包括如下步骤：
[0016](1)提取水稻基因组DNA作为模板(可采用CTAB法)，加入上述2种引物进行PCR扩增；
[0017](2)PCR产物用MaeII进行酶切反应。
[0018](3)取酶切产物用凝本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种水稻直链淀粉含量基因ACF1等位基因的分子标记，其特征在于，在低直链淀粉含量的软米水稻中，其ACF1基因编码区655bp
‑
658bp处为ACGT；在中直链淀粉含量的非软米水稻中，ACF1基因编码区655bp
‑
658bp处为GCGT。2.一种检测水稻直链淀粉含量基因ACF1等位基因的引物，其特征在于，其核苷酸序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。3.根据权利要求2所述检测水稻直链淀粉含量基因ACF1等位基因型的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。4.一种检测水稻低直链淀粉含量基因ACF1等位基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以水稻总DNA为模板，用权利要求2或3所述的引物进行PCR扩增；(2)将步骤(1)的产物用MaeⅠ酶切；(3)将步骤(2)的酶切产物用凝胶电泳检测。5.根据权利要求4所述检测水稻低直链淀粉含量基因ACF1等位基因的方法，其特征在于：水稻总DNA来源于ACF1
655A
软米等位基因型软米水稻时，酶切产物含有分子量约为231bp和82bp的两种条带；水稻总DNA来源于ACF1
655G
非软米等位基因型水稻时，酶切产物为分子量约313bp的条带；水稻总DNA来源于ACF1
655G
非软米等位基因型水稻与ACF1
655A
软米等位基因型水稻杂交后代的杂合子水稻时，酶切产物含有约分子量为313bp、231bp和82bp三种条带；水稻总DNA来源于ACF1
655A
软米等位基因型水稻与ACF1
655G
非软米等位基因型水稻杂交F1植株再自交的后代水稻时，纯合ACF1
655A
软米等位基因型水...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵国超，李建粤，王彤，谢水锋，宗士鹏，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：
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