一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法及应用，成年蚊子的中肠被分离并在PBS中涡旋粉碎，以将肠道菌群完全释放到缓冲液中，在30℃下，在LB培养基上，连续稀释10μL匀浆，培养过夜，通过显微观察，在LB培养基上描绘了在菌落形态，透明度，大小，光泽和颜色上有明显差异的细菌，总共获得了13个菌株，13个菌株的全长16SrRNA均被扩增，测序数据在生物信息中心上传收录号GCA_001976145.1，并确定了S.oryzae菌落，本发明专利技术从白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae，并验证了其在体内和体外增强杀虫剂抗性的作用，S.oryzae可被商业用于分解农田和湖泊中残留的杀虫剂，以保护环境。境。

【技术实现步骤摘要】
一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种分离共生菌S.oryzae的方法，特别涉及一种白纹伊蚊中 分离出肠道共生菌S.oryzae的方法及应用，属于共生菌S.oryzae


技术介绍

[0002]白纹伊蚊是蚊科、伊蚊属的昆虫类动物。小型到中型蚊虫。雌蚊体形中 等，黑色。中胸盾片有一白色纵条，通常后部逐渐细削，并在小盾片前区分 叉。盾片两侧翅基前有一簇宽白鳞，盾角无鳞簇。前胸后背片及翅前、翅上 鳞簇不连成一纵线，中胸腹侧板和后侧片的鳞簇明显分开。足的踏节有基白 环，踏节5全部或大部白色，小盾片3叶被白鳞。腹节2—6背板具基白带， 雄蚊腹节9背板呈山峰状，中央有一突起。幼虫栉齿基部具细穗；尾鞍不完 全；腹毛1
‑Ⅶ
通常分4枝，2
‑Ⅶ
通常单枝。
[0003]白纹伊蚊对杀虫剂耐药性不断增强，使包括中国在内的亚洲和非洲许多 国家面临蚊媒病流行的巨大风险，迄今为止，越来越多的研究集中在肠道共 生细菌与其宿主对杀虫剂的抗性之间的关系上，这为研究抗性机制提供了一 个新的方面。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方 法及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种白纹伊蚊中分离出肠 道共生菌S.oryzae的方法，包括以下步骤：
[0006]S1：选择白纹伊蚊易感菌株，白纹伊蚊易感菌株要在研究所培育了超过 20年的时间，没有接触过任何种类的杀虫剂，使用杀伤浓度为50％的溴氰菊 酯对每一代幼虫阶段处理，筛选出抗杀虫剂菌株，并将筛选后的存活者用于 繁殖下一代；
[0007]S2：超过3年时间的筛查，与敏感蚊子相比，其抗性比为109.6，第52 代蚊子被认为是耐药菌株，捕获田间蚊虫，并在实验室中稳定饲养，用猪肝 粉和酵母粉的混合物喂养幼虫；将成年蚊子转移到蚊子笼中，用10％葡萄糖溶 液喂养，并通过Hemotek装置喂饲羊血；测试幼虫杀虫剂耐药性的生物测定 是按照世界卫生组织指南进行的：耐药性比RR＝耐药菌株LC50/易感菌株LC50； 每种菌株的溴氰菊酯LC50列在Table1中，以显示其抵抗和易感状态曲线变 化，成年蚊子的生物测定使用CDC瓶法进行，具有0.03％的溴氰菊酯膜；
[0008]S3：用75％酒精消毒成年蚊子的表面3分钟，然后用无菌的1
×
PBS缓冲 液冲洗2分钟，对于每个菌株，设置了五个生物重复组，通过超声粉碎肠道 样本组织，按照DNA分离试剂盒的说明提取总DNA，用引物27F/1492R扩增 16SrRNA基因的全长，将PCR反应置于10μL反应体系中，对PCR产物进行纯 化、定量和均质化，以创建测序文库SMRT Bell，在质量检查之后，使用单分 子测序仪PacBio Sequel进行文库测序，QIIME软件中的UCLUST用于以97％ 的相似度对标签进行聚类，并获得了OTU操作分类单元；
[0009]S4：对白蚊伊蚊不同菌株的肠道共生菌进行了三个不同方面的鉴别筛选， 实验室
耐药蚊虫和敏感毒株蚊虫为一组，野外捕获的耐药蚊虫为一组，捕获 的易感蚊子以及氨氯菊酯处理前后的蚊虫一组，进行了比较；
[0010]以LC5038.03μg/L的溴氰菊酯对野外捕获的耐药蚊子的幼虫进行处理， 观察杀虫剂压力下共生菌组成和多样性的变化，超过200只正常活跃的幼虫 用溴氰菊酯处理，而对照组则常规喂养，24h后，从两组选择正常活性的幼虫 作为试验样品，每组有5个生物重复，16SrRNA的提取，实验室耐药蚊虫和敏 感毒株蚊虫的测序和分析以及捕获的易感蚊子以及氨氯菊酯处理前后的蚊子 的测序和分析均同上进行；
[0011]S5：成年蚊子的中肠被分离并在PBS中涡旋粉碎，以将肠道菌群完全释 放到缓冲液中，在30℃下，在LB培养基上，连续稀释10μL匀浆，培养过夜， 通过宏观观察，在LB培养基上描绘了在菌落形态，透明度，大小，光泽和颜 色上有明显差异的细菌，总共获得了13个菌株，13个菌株的全长16SrRNA均 被扩增，测序数据在生物信息中心中收录为GCA_001976145.1，并确定了 S.oryzae菌落，用革兰氏和荚膜孢子染色对分离的菌落进行染色，并使用浸 油显微镜检查形态学特征。
[0012]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S2的养殖条件如下：温度： 26℃
±
2；相对湿度：75％
±
5；光周期：12小时。
[0013]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S3中，反应体系的条件如下： 95℃，5分钟；95℃持续30s；50℃持续30s；72℃持续1分钟，共进行30次 循环。
[0014]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S5中，为了证实S.oryzae 菌落可以通过人工喂养在白蚊伊蚊的肠道中积累，构建了表达eGFP的 S.oryzae用于人工喂养，质粒pET28
‑
sfGFP同时表达绿色荧光蛋白和卡那霉 素耐药性，根据TaKaRa试剂盒的使用说明，使用CaCl2化学转移方法将其转 化为合格的S.oryzae，具有操作如下：
[0015]在180转每分钟，30℃的条件下，将GFP标记的S.oryzae在富含50μg/mL 卡那霉素LB汤中培养过夜，将培养物以3000g离心10分钟，并使用重复离 心和无菌PBS洗涤三次获得的细菌沉淀，将细菌与5％无菌葡萄糖溶液混合， 在葡萄糖水中得到GFP标记的谷黄链球菌溶液，谷黄链球菌溶液简称GBS；OD
600
调节至0.5
‑
0.8，在饥饿状态下闭合后一天的成年蚊虫连续用蘸有适量GBS的 无菌海绵喂食48小时，海绵每4
‑
6小时更换一次，以减少空气中的细菌污染， 用10％无菌葡萄糖溶液代替GBS，并继续喂养24小时；而对照组总是用10％ 无菌葡萄糖溶液喂养，依次从每组中解剖肠道组织，并将其放置在含有10μ LPBS的载玻片上，以在荧光显微镜下观察绿色荧光。
[0016]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S5中，为了验证去除抗生素 对肠道共生菌的影响，使用了两种方法，即细菌培养和绝对16SrRNA拷贝数 的定量，在细菌培养方法中，以梯度方式将肠组织匀浆稀释10倍至10
‑4；将 每次稀释的10μL在LB板上在30℃下培养48小时，实验组和对照组均涂覆 3种介质，以减少不同涂布技术的误差，计算培养基上相应菌落的数量以计算 CFU/mL，实验重复两次；
[0017]对于16SrRNA拷贝数的估计，合成指酸将已知拷贝数连续稀释10
‑1至10
‑5， 以各样品的DNA和不同浓度的被告作为515F和907R引物RT
‑
qPCR反应的模 板，收集Ct值，得到各样品的拷贝数/μLDNA，并将结果转换为拷贝数/蚊子。
[0018]作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法，包括以下步骤：S1：选择白纹伊蚊敏感菌株，白纹伊蚊敏感菌株已在研究所养蚊室培育了超过20年的时间，没有接触过任何种类的杀虫剂，使用杀伤浓度为50％的溴氰菊酯对每一代幼虫阶段处理，筛选出抗杀虫剂菌株，并将筛选后的存活者用于繁殖下一代；S2：超过3年时间的筛选，与敏感蚊子相比，其抗性比为109.6，第52代蚊子被认为是耐药菌株，捕获于田间蚊虫，并在实验室中稳定饲养，用猪肝粉和酵母粉的混合物喂养幼虫；将成年蚊子转移到蚊子笼中，用10％葡萄糖溶液喂养，并通过Hemotek装置喂饲羊血；测试幼虫杀虫剂耐药性的生物测定是按照世界卫生组织指南进行的：耐药性比RR＝耐药菌株LC50/敏感菌株LC50；每种菌株的溴氰菊酯LC50列在Table1中，以显示其抵抗和易感状态与折叠变化，成蚊的生物测定使用0.03％的溴氰菊酯药膜接触筒法进行；S3：用75％酒精消毒成年蚊子的表面3分钟，然后用无菌的1
×
PBS缓冲液冲洗2分钟，对于每个菌株，设置了五个生物重复组，通过超声粉碎肠道样本组织，按照DNA分离试剂盒的说明提取总DNA，用引物27F/1492R扩增16SrRNA基因的全长，将PCR反应置于10μL反应体系中，对PCR产物进行纯化、定量和均质化，以创建测序文库SMRTBell，在质量检查之后，使用单分子测序仪PacBioSequel进行文库测序，QIIME软件中的UCLUST用于以97％的相似度对标签进行聚类，并获得了OTU操作分类单元；S4：对白蚊伊蚊不同菌株的肠道共生菌进行了三个不同方面的鉴别筛选，实验室耐药蚊子和易感毒株蚊子为一组，野外捕获的耐药蚊子为一组，捕获的易感蚊子以及氨氯菊酯处理前后的蚊子一组，进行了比较；以LC50浓度为38.03μg/L的溴氰菊酯对野外捕获的耐药蚊子的幼虫进行处理，观察杀虫剂选择压力下共生菌组成和多样性的变化，超过200只正常活跃的幼虫用溴氰菊酯处理，而对照组则常规喂养，24h后，从两组选择正常活性的幼虫作为试验样品，每组有5个生物重复，16SrRNA的提取，实验室耐药蚊子和敏感株蚊子的测序和分析以及捕获的敏感蚊子以及溴氰菊酯处理前后的蚊子的测序和分析均同上进行；S5：成年蚊子的中肠被分离并在PBS中涡旋粉碎，以将肠道菌群完全释放到缓冲液中，在30℃下，在LB培养基上，连续稀释10μL匀浆，培养过夜，通过宏观观察，在LB培养基上描绘了在菌落形态，透明度，大小，光泽和颜色上有明显差异的细菌，总共获得了13个菌株，13个菌株的全长16SrRNA均被扩增，测序数据在生物信息中心中收录号GCA_001976145.1，并确定了S.oryzae菌落，用革兰氏和荚膜孢子染色对分离的菌落进行染色，并使用浸油显微镜检查形态学特征。2.根据权利要求1所述的一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法，其特征在于：所述步骤S2的养殖条件如下：温度：26℃
±
2；相对湿度：75％
±
5；光周期：12小时。3.根据权利要求1所述的一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法，其特征在于：所述步骤S3中，反应体系的条件如下：95℃，5分钟；95℃持续30s；50℃持续30s；72℃持续1分钟，共进行30次循环。4.根据权利要求1所述的一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法，其特征在于：所述步骤S5中，为了证实S.oryzae菌落可以通过人工喂养在白蚊伊蚊的肠道中积累，构建了表达eGFP的S.oryzae用于人工喂养，质粒pET28
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sfGFP同时表达绿色荧光蛋白和卡那霉素耐药性，根据TaKaRa...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏美，郭秀霞，公茂庆，王海洋，彭荟，王海防，刘丽娟，张崇星，程鹏，
申请(专利权)人：山东省寄生虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：