一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，其制备方法为：取干燥土鳖虫打粉，加入乙醇中，回流提取，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥，得土鳖虫乙醇提取物EE粉末；将土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物及其应用


[0001]本专利技术涉及一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物及其制备方法。

技术介绍

[0002]土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)或冀地鳖(Steleophaga plancyi(Boleny))的雌虫干燥体。性寒，味咸，有小毒，归肝经，属活血化瘀药，是一味历史悠久、使用广泛的名贵动物药。动物药素有“血肉有情之品”和“行走通窜之物”之说，在活血化瘀、攻坚破积、搜风通络和消癥散结等方面，有着植物药、矿物药难以企及的活性和疗效，已成为中医药防治疾病不可或缺的重要动物药资源。目前认为它既可作为中医临床使用，也具有一定的食用保健价值。有许多医药典籍对其都有相关记载，如《神农本草经》、《金匮要略》、《本草纲目》等。土鳖虫药用价值高，应用广泛。除了作为多种中成药的主要成分，还在临床上广泛用于治疗跌打损伤、各种肝脏疾病、骨折产后瘀血等。如其方剂下瘀血汤、大黄蛰虫丸等。
[0003]氨基酸、多肽、蛋白质是动物药中普遍存在的主要成分，其中大多数还被现代研究证实是动物药的特效成分。土鳖虫是优质蛋白质的极好来源，目前已经从土鳖虫中分离出多种活性多肽及蛋白成分，这些成分拥有强烈的抗肿瘤、抗凝血\抗血栓形成、抗氧化、降血脂、护肝与免疫调节活性。即便如此，但目前得到明确鉴定的有效活性成分并不多，对其所含的各成分作用机制也不是很明确。关于土鳖虫多肽及蛋白类成分的研究难点是分离纯化和结构鉴定。过低的分离率与成分的多样化程度的结合，使得对土鳖虫大分子成分的结构与功能认识严重缺乏，为此需要进一步的发现功能性的土鳖虫类大分子成分及药理药效的作用机制。
[0004]肝脏是代谢中心，参与许多重要的生理功能。肝细胞病变化导致肝损伤，而作为各种肝病最常见的病理过程，肝损伤可发展为肝硬化、肝纤维化、肝癌等严重疾病，对人体健康造成危害。从古至今，土鳖虫不管是作为单味药还是作为经方，都广泛地用于治疗各种肝脏器官的疾病。如经方下瘀血汤，用于治疗慢性肝炎，肝纤维化；大黄蛰虫丸用于治疗病毒性肝炎，肝硬化等。
[0005]本专利技术深入研究中药土鳖虫中治疗肝病(主要包括肝癌与肝纤维化)相关的药效成分，利用细胞评价技术来对土鳖虫中具有抑制肝异常细胞增殖作用的部位与成分进行研究，开发新的活性蛋白。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术的目的是通过系统分离纯化土鳖虫中的活性蛋白成分，并采用体外细胞评价技术研究各分离产物的抗肝癌与抑制肝纤维化活性，逐步聚焦有效部位与成分。本专利技术首先将盐析土鳖虫粗蛋白产物按分子量不同将其分为EEPA、EEPB及EEPC三个不
同的蛋白部位，分子量最大的蛋白部位EEPC表现出最高的抑制肝异常细胞增殖活性。接着经过DEAE阴离子层析及Sephadex G
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100凝胶层析从EEPC中分离出一种分子量为10kDa左右纯化蛋白PC3
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III，体外实验证明PC3
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III具有与EEPC相当的体外抗肝癌及抑制肝纤维化的活性，通过抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移来发挥抗肝癌药效，并且还能抑制活化的HSC细胞增殖从而延缓肝纤维化的进程。
[0007]技术方案：为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：
[0009](1)取干燥土鳖虫打粉，加入乙醇中，回流提取，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥，可得土鳖虫乙醇提取物EE粉末，使用前避光存储于
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20℃条件；
[0010](2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀，复溶后透析以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP。
[0011]作为优选方案，以上所述的一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，它是通过以下方法制备得到的：
[0012](1)取干燥土鳖虫打粉，加入5～20倍体积量的20～30％乙醇，60
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75℃条件回流提取1～3次，每次1～2h，弃去残渣，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥可得土鳖虫乙醇提取物EE粉末，使用前避光存储于
‑
20℃条件；
[0013](2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于30mM Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀复溶后透析36h以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP。
[0014]一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，它是通过以下方法制备得到的：
[0015](1)取干燥土鳖虫打粉，加入乙醇中，回流提取，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥，可得土鳖虫乙醇提取物EE粉末，使用前避光存储于
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20℃条件；
[0016](2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀，复溶后透析以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP；
[0017](3)将粗蛋白土鳖虫粗蛋白样品EEP复溶在Tris
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HCl缓冲液中，并先后使用截留分子量为10kDa与3kD的超滤离心管连续2次的离心，按照分子量将EEP溶液分为3个蛋白部位截留液，收集并冷冻干燥，命名为分子量＜3k的EEPA、分子量3～10k的EEPB及分子量＞10k的EEPC。
[0018]作为优选方案，以上所述的一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，它是通过以下方法制备得到的：
[0019](1)取干燥土鳖虫打粉，加入5～20倍体积量的20～30％乙醇，60
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75℃条件回流提取1～3次，每次1～2h，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥可得土鳖虫乙醇提取物EE粉末，使用前避光存储于
‑
20℃条件；
[0020](2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于30mM Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀复溶后透析36h以脱
除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP；
[0021](3)将土鳖虫粗蛋白样品EEP粉末复溶在30mM Tris
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HCl缓冲液中，并先后使用截留分子量为10kDa与3kD的超滤离心管连续2次的离心分离，按照分子量将EEP溶液分为3个蛋白部位截留液，收集并冷冻干燥，命名为分子量＜3k的EEPA、分子量3～10k的EEPB及分子量＞10k的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：(1)取干燥土鳖虫打粉，加入乙醇中，回流提取，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥，得土鳖虫乙醇提取物EE粉末；(2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀，复溶后透析以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP。2.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：(1)取干燥土鳖虫打粉，加入5～20倍体积量的20～30％乙醇，60
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75℃条件回流提取1～3次，每次1～2h，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥可得土鳖虫乙醇提取物EE粉末；(2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于30mM Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀复溶后透析36h以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP。3.一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：(1)取干燥土鳖虫打粉，加入乙醇中，回流提取，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥，可得土鳖虫乙醇提取物EE粉末；(2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀，复溶后透析以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP；(3)将粗蛋白土鳖虫粗蛋白样品EEP复溶在Tris
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HCl缓冲液中，并先后使用截留分子量为10kDa与3kD的超滤离心管连续2次的离心，按照分子量将EEP溶液分为3个蛋白部位截留液，收集并冷冻干燥，命名为分子量＜3k的EEPA、分子量3～10k的EEPB及分子量＞10k的EEPC。4.根据权利要求3所述的一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：(1)取干燥土鳖虫打粉，加入5～20倍体积量的20～30％乙醇，60
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75℃条件回流提取1～3次，每次1～2h，弃去残渣，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥可得土鳖虫乙醇提取物EE粉末，使用前避光存储于
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20℃条件；(2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于30mM Tris
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HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，再静置，离心，收集沉淀复溶后透析36h以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP；(3)将土鳖虫粗蛋白样...

【专利技术属性】
技术研发人员：王令充，谢佳雨，刘涛，虞晓弦，嵇晶，程建明，狄留庆，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：