一种免疫磁珠及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种免疫磁珠及其制备方法与应用，该免疫磁珠是将ActA单克隆抗体3G11和羧基磁珠共价偶联制得。可利用该免疫磁珠制得试剂盒。通过利用免疫磁珠或试剂盒可以快速、高效的检出单核细胞增生李特菌，具有特异性好、检测速度快、操作简便和结果可靠等优点，适用于多种来源样品的检测，为实现单核细胞增生李斯特菌的快速检测提供了前提条件，可以广泛应用于生活及临床检测中。应用于生活及临床检测中。应用于生活及临床检测中。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫磁珠及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种免疫磁珠及其制备方法与应用，属于生物检测
本专利技术是申请号为202210339643.3，专利技术名称为分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的分案申请。

技术介绍

[0002]单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性人兽共患致病菌，具有广泛的宿主谱，能引起人和动物的李斯特菌病。该菌感染动物后给养殖场造成严重的经济损失，动物携带的Lm经屠宰加工环节进入食物链，沿着动物产品加工、运输、销售环节到了餐桌，引起人类的感染，死亡率高达30％，严重危害了人类健康。
[0003]加强对动物养殖环节李斯特菌病的筛查，能够在感染初始阶段发现并采取相应的防控措施，从而阻止患病家畜进入食品产业链，对公众卫生安全具有重要意义。病原菌分离培养的方法耗时长，不能满足快速检测的需求，且只在动物发病的特定阶段检测出。目前，血清学方法是检测李斯特菌病的重要依据之一，该方法能够利用已知的细菌或者细菌抗原，对体液中有无相应的抗体进行检测，从而实现对传染性疾病的诊断。此外，ActA是Lm重要的毒力因子，位于细胞壁表面且被证实具有较强的免疫原性。选用Lm表面蛋白ActA作为检测抗原，建立竞争ELISA检测方法，实现对李斯特菌病的有效防控意义重大。
[0004]传统的细菌分离培养是检测单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)的金标准，但该技术耗时长，不能满足快速检测需求。基于核酸的病原学检测方法耗时较短，灵敏度较高，但容易受到样品种类、模板和引物等多种因素影响，对仪器设备有较高要求。而基于抗原和抗体的免疫学检测方法较好地弥补了传统检测方法和分子生物学方法的不足，在食源性疾病的检测和控制中应用广泛。其中免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic beads technology，IMBS)以其高特异性及固相化试剂较好的稳定性等优势而被广泛研究。此外，单克隆抗体(ActA)是Lm重要的毒力因子，位于细胞壁表面且被证实具有较强的免疫原性。因此如何快速特异地检出食品中的Lm显得尤为重要。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术的所要解决的技术问题是提供了一株杂交瘤细胞株。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了由杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到的ActA单克隆抗体。
[0007]本专利技术的还要解决的技术问题是提供了含有ActA单克隆抗体编码的多核苷酸。
[0008]本专利技术的还要解决的技术问题是提供了所述的ActA单克隆抗体、所述的多核苷酸在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术的还要解决的技术问题是提供了检测单核细胞增生李斯特菌的竞争ELISA检测试剂盒。
[0010]本专利技术还要解决的技术问题是提供了用于检测单核细胞增生李斯特菌的免疫磁
珠及其制备方法和应用。
[0011]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了含有该免疫磁珠或免疫磁珠制成的试剂盒。
[0012]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一株分泌单核细胞增生李斯特菌抗体的杂交瘤细胞株3G11，于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2021174，保藏地址为中国武汉大学，分类命名为：杂交瘤细胞株3G11。
[0013]本
技术实现思路
还包括ActA单克隆抗体，其由上述的杂交瘤细胞株3G11或其传代细胞株分泌得到。
[0014]其中，所述的ActA单克隆抗体包括重链和轻链。
[0015]其中，所述轻链包括三个互补决定区，所述轻链的三个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0016]其中，所述重链包括三个互补决定区，所述重链的三个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0017]其中，所述轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0018]其中，所述重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0019]本专利技术还包括一种多核苷酸，其多核苷酸编码为本专利技术所述ActA单克隆抗体。
[0020]其中，所述多核苷酸中轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0021]其中，所述多核苷酸中重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0022]本
技术实现思路
还包括所述的ActA单克隆抗体、所述的多核苷酸在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试剂盒中的应用。
[0023]本
技术实现思路
还包括一种检测单核细胞增生李斯特菌的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含所述的ActA单克隆抗体或所述的多核苷酸。
[0024]其中，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。所述阳性对照为单核细胞增生李斯特菌阳性血清，所述阴性性对照为单核细胞增生李斯特菌阴性血清。
[0025]其中，所述检测试剂盒还包括包被抗原、包被液、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液和反应终止液。
[0026]本
技术实现思路
还包括检测单核细胞增生李斯特菌中应用的竞争ELISA检测方法，包括以下步骤：
[0027](1)将检测抗原用包被液稀释，用PBST洗涤，封闭，洗涤；
[0028](2)稀释液稀释后的单核细胞增生李斯特菌阳性和阴性血清加至步骤(1)的抗原中，孵育；
[0029](3)加入稀释液稀释后的HRP标记的针对该菌表面蛋白的抗体，孵育，洗涤；
[0030](4)加入显色液，显色后加入终止液，检测吸光度值，分析结果。
[0031]其中，所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
[0032]其中，所述洗涤使用的洗涤液为pH 7.2的PBST溶液。
[0033]其中，所述封闭使用的封闭液为含有2
‑
5％脱脂奶粉的PBS溶液。
[0034]其中，所述稀释液为含有1
‑
2％BSA的PBS溶液。
[0035]其中，所述终止液为0.5
‑
2mol/L的H2SO4溶液。
[0036]本
技术实现思路
还包括一种荧光标记单核细胞增生李斯特菌的间接ELISA方法，包括
以下步骤：
[0037](1)在24孔板内提前加入爬片，将细胞系或原代细胞与Lm菌液按照MOI＝20:1的比例混合均匀，每孔中均加入1mL混合液，37℃孵育7
‑
8h；
[0038](2)洗涤，于(1)中每孔加入400μL封闭液，37℃封闭2
‑
3h；
[0039](3)于(2)中每孔加入400μL，稀释液稀释后的ActA单抗溶液，孵育，洗涤；
[0040](4)于(3)中每孔加入400μL，稀释液稀释后的Goat Anti
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠由ActA单克隆抗体3G11与活化后的羧基磁珠共价偶联制得。2.一种权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与MEST溶液混合，分离静置，弃上清，重悬于MEST溶液中，洗涤后羧基磁珠重悬于MEST溶液中得到磁珠悬液，向磁珠悬液中加入活化试剂，振荡混匀，得到活化后的羧基磁珠溶液；(2)抗体的偶联：将ActA单克隆抗体3G11与活化的羧基磁珠溶液混合，用MEST溶液调节总体积，混匀，孵育偶联，即得免疫磁珠。3.根据权利要求2所述的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，赵梦迪，殷月兰，孟凡增，陈祥，黄金林，潘志明，顾丹，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：