一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备方法与应用。其中羊支原体肺炎平板凝集抗原使用丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株制成，其中3种支原体菌体的灭活前浓度均为7.0

【技术实现步骤摘要】
一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于兽医诊断
，具体涉及一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]羊支原体肺炎，又称羊传染性胸膜肺炎，是由支原体引起的一种高度接触性传染病，临床上表现为高热、咳嗽胸腔浆液性和纤维素性炎症，传入性强，急性病例表现为肺炎，死亡率高，慢性病例主要表现为关机炎、乳房炎、腹膜炎等。该病在世界范围内广泛存在，我国主要养羊省份均存在该病，特别是内蒙古、青海、新疆、山东等养羊规模较大、密度较高的省份。我国最早于1935年内蒙古就有类似该病的记录，1942年～1943年在甘肃报告过羊传染性胸膜肺炎的流行，其后直到当前，在内蒙、东北、华北等地也出现过该病，其发病率在10～90％，死亡率通常在0.85～60％，最高可达100％。该病给我国养羊业造成巨大的经济损失，严重影响养羊业的长期健康发展。
[0003]引起羊支原体肺炎的病原种类较多，主要包括丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体3种病原，也有学者认为丝状支原体丝状亚种也能感染引山羊起肺炎，但病例不常见。其中丝状支原体山羊亚种可感染山羊和绵羊，3岁以下山羊最为易感；山羊支原体山羊亚种只感染山羊，绵羊不易感；绵羊肺炎支原体可感染山羊和绵羊。感染羊是最主要的传染源，传播途径主要通过接触传播和空气传播，引起绵羊支原体肺炎可以由一种支原体感染引起，也可以由2种或3种支原体混合感染所致。当前我国获得批准的羊支原体病检测试剂产品有绵羊肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒、山羊传染性胸膜肺炎间接血凝试验抗原与阴阳性血清、绵羊支原体肺炎间接血凝试验抗原与阴阳性血清和山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测试纸条4种产品，但中国兽药信息网的国家基础数据库(http://vdts.ivdc.org.cn:8081/cx/)显示，以上产品批准至今，均无生产和批签发记录，由此可判断当前我国批准生产的羊支原体检测试剂均没有进行实际生产和销售，分析其原因可能是产品与实际需求存在差距，无法满足当前生产需要。当前能引起羊支原体肺炎的主要有3个支原体种类，而获得批准的4个产品均只能检测其中的1种，容易引起误判，而且丝状支原体山羊亚种感染没有相应的检测试剂。因此，缺乏一种能一次检测多种羊支原体感染的试剂，如果能简单快速、可视化，则更能符合现场检测的市场需求。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备方法与应用。选用丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株研制开发的羊支原体肺炎平板凝集抗原及其对照血清，用于羊血清中羊支原体抗体的快速检测，有助于解决我国当前羊支原体感染检测和防控中的问题。
[0005]为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]提供一种羊支原体肺炎平板凝集抗原，其使用丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊
支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株制成，其中3种支原体菌体的灭活前浓度均为7.0
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CCU/mL。
[0007]提供一种羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)将丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株分别接种于羊支原体培养基，传代后制成3种基础种子菌液；
[0009](2)将3种基础种子液分别接种于羊支原体培养基中扩大培养，获得3种生产种子液；
[0010](3)将3种生产种子液分别进行发酵培养，并对菌液进行CCU计数和无菌检验；
[0011](4)在3种发酵培养菌液中分别加入含硫柳汞的PBS重悬灭活，按CCU计数结果调整菌液浓度，将3种重悬后的菌液按体积比1:1:1混合，加入结晶紫溶液染色和甘油制备得到羊支原体肺炎平板凝集抗原，混匀后分装保存。
[0012]进一步地，羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法具体包括以下步骤：
[0013](1)基础种子液的制备：取丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株冻干菌种，开启后，分别按10％的量接种羊支原体培养基，置37℃培养18～36h收获后作为一级基础种子，将一级种子液按10％比例再接种传代1次，收获分装后置
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80℃冻存，作为二级基础种子；
[0014](2)生产种子液的制备：取丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株的二级基础种子，按10％比例分别接种于生产用羊支原体培养基，置37℃恒温摇床，120rpm震荡培养18～36h至培养基变为黄色，扩大培养，获得生产种子液；
[0015](3)发酵培养：采用生物反应器分别大规模培养丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株，先对生物反应器进行灭菌，无菌加入羊支原体培养基，按1:10的比例接种生产种子液，37℃恒温培养，严格控制不通气，待pH下降至6.9～7.0时，添加羊支原体培养基为原培养体积的20％，进行两次补料培养，待第二次培养pH下降到6.7～6.8时收获菌液，并对菌液进行CCU计数和无菌检验；
[0016](4)抗原制备，在3种菌液中分别加入0.2～0.4％羟甲基纤维素钠，置2～8℃静置7～10日，8000rpm离心菌液20min，取沉淀用含0.01％硫柳汞的PBS重悬，按照CCU计数结果，调整菌液浓度为2.3
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CCU/mL，置37℃灭活3小时，将3种重悬后的菌液按体积比1:1:1混合，反复搅拌均匀后，加入3％结晶紫溶液至终浓度为0.03％，继续搅拌20分钟，加入10％菌液体积的甘油，继续搅拌10分钟，即得到羊支原体肺炎平板凝集抗原，分装后置2～8℃保存。
[0017]提供一种羊支原体肺炎平板凝集抗原在羊支原体肺炎检测中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果为：
[0019]1.本申请提供的羊支原体肺炎平板凝集抗原，相比当前国内已经注册的羊支原体病检测试剂产品，具有检测范围较广的特点，能同时检测3种支原体感染，而且使用简单、直观，普通饲养员，按照说明书即可使用，并进行结果判定。对于养殖企业和农户来讲，只需要知道羊群是否有支原体感染即可，无需确定由何种支原体感染，无论哪种支原体感染，在使用抗生素或药物治疗上没有区别。
[0020]3.本申请提供的羊支原体肺炎平板凝集抗原生产成本和检测成本低，有利于规模
化生产和推广应用。
[0021]4.本申请提供的羊支原体肺炎平板凝集抗原在保存条件为2～8℃下，可保存3年以上，室温下可保存2个月以上，便于运输和存放。
附图说明
[0022]图1为实施例4羊支原体平板凝集抗原与被检羊血清反应结果判定示意图，其中从左至右依次为弱阳性(++)、阳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羊支原体肺炎平板凝集抗原，其特征在于，使用丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株制成，其中3种支原体菌体的灭活前浓度均为7.0
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CCU/mL。2.一种权利要求1所述的羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株分别接种于羊支原体培养基，传代后制成3种基础种子菌液；(2)将3种基础种子液分别接种于羊支原体培养基中扩大培养，获得3种生产种子液；(3)将3种生产种子液分别进行发酵培养，并对菌液进行CCU计数和无菌检验；(4)在3种发酵培养菌液中分别加入含硫柳汞的PBS重悬灭活，按CCU计数结果调整菌液浓度，将3种重悬后的菌液按体积比1:1:1混合，加入结晶紫溶液染色和甘油制备得到羊支原体肺炎平板凝集抗原，混匀后分装保存。3.根据权利要求2所述的羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)基础种子液的制备：取丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株冻干菌种，开启后，分别按10％的量接种羊支原体培养基，置37℃培养18～36h收获后作为一级基础种子，将一级种子液按10％比例再接种传代1次，收获分装后置
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80℃冻存，作为二级基础种子；(2)生...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈青春，蒋卉，丁家波，范学政，鑫婷，张广智，秦彤，汤新明，梁瑞英，梁琳，李松励，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：