【技术实现步骤摘要】
一种建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法
[0001]本专利技术属于胆囊癌诊断及治疗
，尤其涉及一种建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法。
技术介绍
[0002]胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，其恶性程度高、起病隐匿、预后较差。目前胆囊癌尚无明确的早期诊断和筛查手段，大量早期胆囊癌在初步诊断为胆囊良性占位并行胆囊切除术的患者中发现，即意外发现的胆囊癌。目前唯一可能根治胆囊癌的治疗手段是手术治疗，但仍该尚无有效的综合治疗方案。深入了解胆囊癌细胞株的生物学特性，建立科学稳定的动物模型，有利于研究者针对不同的研究目的，在研究设计中选择不同的细胞系和动物模型。本研究旨在为胆囊癌相关转化医学研究提供基础参照，并对进一步的早期诊断和综合治疗研究起到一定的先导作用。
[0003]来源于人胆囊癌细胞系目前主要有EH
‑
GB1、SGC
‑
996、GBC
‑
SD、NOZ等品系，胆囊癌的动物模型目前主要有皮下成瘤动物模型、原位移植动物模型和脾内接种法肝转移动物模型，至今尚无成功的胆囊癌自发成瘤动物模型。
[0004]因此，针对以上现状，迫切需要开发一种建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，以克服当前实际应用中的不足。
技术实现思路
[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术实施例的目的在于提供一种建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：>[0007]一种建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，所述方法的具体步骤如下：
[0008]步骤一、准备实验动物、细胞、主要试剂和仪器；
[0009]步骤二、细胞培养；
[0010]步骤三、采用CCK
‑
8法对细胞的增殖活性进行检测；
[0011]步骤四、克隆形成实验检测细胞克隆数；
[0012]步骤五、采用8.0μm孔径的聚碳酸酯膜Transwell板和人工基质胶涂覆膜Transwell板测定胆囊癌的侵袭能力以及侵袭细胞数；
[0013]步骤六、异种移植肿瘤模型的建立；
[0014]步骤七、HE染色实验，根据HE染色试剂盒指示，对固定标本进行HE染色，于光学显微镜下进行病理组织学观察和拍照，观察肿瘤组织、淋巴结及主要脏器转移情况；
[0015]步骤八、免疫荧光实验，检测肿瘤组织及转移淋巴结中VEGF、LYVE
‑
1和PDL
‑
1蛋白的表达和定位；
[0016]步骤九、采用统计软件，对得到数据进行统计分析。
[0017]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤一中，实验动物为30只6周龄SPF级雄性
BALB/c裸鼠，细胞为GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞，主要试剂为胎牛血清、DMEM培养基、小鼠抗人血管内皮生长因子A、淋巴管内皮受体－1、细胞程序性死亡－配体1和DAPI抗体，仪器为正置荧光拍照显微镜。
[0018]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤二中，取步骤一中的GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞，将其常规培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在条件为37℃、5％CO2的培养箱中对其进行培养，每2d更换1次DMEM培养基，待细胞铺满培养瓶底面90％后，用0.25％胰蛋白酶对其进行消化传代，传代后的细胞接种在培养板内并进行实验。
[0019]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤三中，取步骤二中生长状态良好的GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞，分别置于96孔细胞培养板中，且每个孔内细胞数为5
×
103个，再对其分别培养24、48和72h后，每孔加入10μLCCK
‑
8试剂并孵育3h，采用酶标仪测量波长450nm处的吸光度值，实验重复3次，再根据吸光度值的平均值绘制细胞生长曲线。
[0020]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤四中，取生长状态良好的GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞，分别置于24孔细胞培养板中，且每个孔内细胞数为200个，分别对其培养7d后，采用吉姆萨染色法进行染色，并对克隆进行拍照，实验重复3次。
[0021]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤五中，取生长状态良好的GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞分别重悬于无血清DMEM培养基中，并配置成细胞密度为5
×
105个/mL的细胞悬液；然后将200μL细胞悬液接种在上室中，将800μL含10％胎牛血清的DMEM培养基加入下室；培养板置于条件为37℃的CO2培养箱中培养24h，用棉签彻底除去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内4％多聚甲醛固定20min，结晶紫溶液染色15min，倒置显微镜随机从5个视野中计数侵袭的细胞数量，实验重复3次，侵袭细胞数以3次实验的平均值表示。
[0022]作为本专利技术进一步的技术方案，所述步骤六的具体步骤如下：
[0023]步骤一、小鼠适应饲养1周后，随机分成GBC
‑
SD组、NOZ组和SGC
‑
996组，每组10只，分别在对应组别裸鼠腹股沟区皮下接种GBC
‑
SD及NOZ细胞悬液0.2mL，约0.5
×
107个细胞；
[0024]步骤二、正常对照组裸鼠腹股沟区皮下注射0.2mLPBS，每天观察裸鼠的一般情况，成瘤及肿瘤生长情况，腹股沟区有无红肿及坏死，每3天测量体重及肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积，肿瘤体积(V)＝0.5
×
长度
×
宽度2；
[0025]步骤三、当瘤体达到1200mm3时视为人道终点，第21天全部小鼠采用麻醉后颈椎离断处死；
[0026]步骤四，首先行大体观察，观察裸鼠瘤体的大小及形状以及体表各部位成瘤情况，然后进行解剖，观察内脏器官及腹主动脉旁淋巴结转移情况；
[0027]步骤五、取肿瘤组织及腹主动脉旁淋巴结，通过游标卡尺测量长和短径，计算肿瘤体积，并取肝脏、肺脏、胰腺和肾脏等内脏器官连同肿瘤组织及淋巴结分别置于福尔马林液固定液中，常规石蜡包埋、切片，进行后续实验。
[0028]作为本专利技术进一步的技术方案，所述步骤八的具体方法步骤如下：
[0029]步骤一、将组织切片脱蜡至水后抗原微波修复15min，自然冷却至室温；
[0030]步骤二、血清封闭30min甩掉封闭液，添加一抗，于4℃孵育过夜；
[0031]步骤三、PBS将封闭液洗涤后滴加二抗，避光，室温孵育60min；
[0032]步骤四、PBS将封闭液洗涤后滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
[0033]步骤五、PBS将封闭液洗本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：步骤一、准备实验动物、细胞、主要试剂和仪器；步骤二、细胞培养；步骤三、采用CCK
‑
8法对细胞的增殖活性进行检测；步骤四、克隆形成实验检测细胞克隆数；步骤五、采用8.0μm孔径的聚碳酸酯膜Transwell板和人工基质胶涂覆膜Transwell板测定胆囊癌的侵袭能力以及侵袭细胞数；步骤六、异种移植肿瘤模型的建立；步骤七、HE染色实验，根据HE染色试剂盒指示，对固定标本进行HE染色，于光学显微镜下进行病理组织学观察和拍照，观察肿瘤组织、淋巴结及主要脏器转移情况；步骤八、免疫荧光实验，检测肿瘤组织及转移淋巴结中VEGF、LYVE
‑
1和PDL
‑
1蛋白的表达和定位；步骤九、采用统计软件，对得到数据进行统计分析。2.根据权利要求1所述的建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，其特征在于，在步骤一中，实验动物为30只6周龄SPF级雄性BALB/c裸鼠，细胞为GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞，主要试剂为胎牛血清、DMEM培养基、小鼠抗人血管内皮生长因子A、淋巴管内皮受体－1、细胞程序性死亡－配体1和DAPI抗体，仪器为正置荧光拍照显微镜。3.根据权利要求1所述的建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，其特征在于，在步骤二中，取步骤一中的GBC
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SD、NOZ和SGC
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996细胞，将其常规培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在条件为37℃、5％CO2的培养箱中对其进行培养，每2d更换1次DMEM培养基，待细胞铺满培养瓶底面90％后，用0.25％胰蛋白酶对其进行消化传代，传代后的细胞接种在培养板内并进行实验。4.根据权利要求1所述的建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，其特征在于，在步骤三中，取步骤二中生长状态良好的GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞，分别置于96孔细胞培养板中，且每个孔内细胞数为5
×
103个，再对其分别培养24、48和72h后，每孔加入10μLCCK
‑
8试剂并孵育3h，采用酶标仪测量波长450nm处的吸光度值，实验重复3次，再根据吸光度值的平均值绘制细胞生长曲线。5.根据权利要求1所述的建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，其特征在于，在步骤四中，取生长状态良好的GBC
‑
SD、NOZ和SGC
‑
996细胞，分别置于24孔细胞培养板中，且每个孔内细胞数为200个，分别对其培养7d后，采用吉姆萨染色法进行染色，并对克隆进行拍照，实验重复3次。6.根据权利要求1所述的建立和分析胆囊癌皮下成瘤动物模型的方法，其特征在于，在步骤五中，取生长状态良好的GB...
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