一种制造技术

本发明专利技术涉及文物检测技术领域，本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种
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N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法


[0001]本专利技术涉及文物检测
，尤其涉及一种
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N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法。

技术介绍

[0002]丝绸是中国古代文明的一种象征，相传嫘祖是最早进行养蚕缫丝的人。近些年来，许多的考古挖掘行动中也都发现了丝织品的存在。由于其特殊的文化和艺术价值，百余年来考古学家们一直致力于探索丝织品的起源。21世纪以来，稳定同位素技术与质谱技术相互融合且彼此促进，取得了极大地发展，是进行丝织品文物溯源的一种有效手段。结合稳定同位素标记的质谱分析技术已经深入到生物分析的多个领域，如蛋白质组学、代谢组学、医学等等领域。
[0003]由于稳定同位素特殊的物理和化学性质，在桑蚕生态过程中会发生一定的分馏。因此，明确桑蚕生长发育及吐丝过程中的同位素的分馏情况是使用稳定同位素技术进行丝织品溯源的前提条件。对桑蚕饲料进行稳定同位素标记并喂养桑蚕是一种高效可行的方法。但是，在对饲料进行稳定同位素标记的同时又容易产生食用安全性问题，在这方面，目前尚无成熟、有效的方法可以借鉴。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种
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N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法。本专利技术方法可有效对桑蚕进行同位素标记，同时又不存在，且制备过程中无有毒副产物的产生，不会对家蚕产生任何的负面影响，对环境友好。
[0005]本专利技术的具体技术方案为：一种
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N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
[0006]1)将桑叶粉，脱脂豆饼粉，甘薯粉，柠檬酸，维生素C，无机盐混合物，没食子酸，山梨酸，氯霉素，琼脂均匀混合，得到初级饲料A。
[0007]2)将产朊假丝酵母在含有
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N同位素标记的基础培养基上培养。
[0008]3)将步骤2)所得培养产物离心收集细胞，水洗，液氮冷冻，最后冷冻干燥。
[0009]4)将步骤3)所得冷冻干燥产物研磨粉碎，按固液比50
‑
70g/L将所得粉末添加至8
‑
12％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在98
‑
102℃下回流提取得到提取物B。
[0010]本专利技术采用三氯乙酸溶液来提取中被
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N同位素标记的蛋白，在三氯乙酸溶液中蛋白质的构像发生改变，从而暴露出较多的疏水性基团，最终三氯乙酸与蛋白质形成不溶性盐而聚集沉淀。
[0011]三氯乙酸浓度很关键，8
‑
12％浓度的三氯乙酸是极酸性物质，加入上述浓度的三氯乙酸会可使溶液呈理想程度的酸性，从而提高蛋白质的提取率。若加入过量的三氯乙酸则会使溶液的酸性过强，导致蛋白质的分解，从而影响蛋白质的完整性。根据实验结果，三氯乙酸的浓度控制在10％左右最为适宜。
[0012]5)将步骤4)中所得提取物B离心处理，除去上层清液，得到离心产物C。
[0013]6)将步骤5)所得离心产物C用乙醇洗涤，然后进行真空干燥，得到干燥提取物D。
[0014]7)按固液比1∶(6
‑
10)g/mL将步骤6)所得干燥提取物D添加至乙醇和氯仿体积比为1.5
‑
2.5∶1的混合溶剂中，在85
‑
95℃下回流提取1
‑
2h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到
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N同位素标记蛋白E。
[0015]我们通过检测发现，三氯乙酸提取而得的产物在经过离心干燥处理后容易有掺杂有部分脂类。为此，本专利技术进一步采用氯仿来迅速溶解脂类，但是我们又发现氯仿其在日光、氧气、湿气中会产生剧毒的光气。为此，本专利技术选择乙醇与氯仿按特定比例复配，乙醇作为氯仿的稳定剂，可解决上述技术问题。
[0016]另一方面，步骤4)中使用三氯乙酸对蛋白质进行沉淀，但我们发现三氯乙酸会渗入蛋白质分子内部而难以去除，经过大量筛选后，我们发现乙醚和丙酮可有效且彻底地去除渗入蛋白质内部的三氯乙酸。因此先用甲醇、乙醚依次对蛋白质沉淀物清洗，再用丙酮进行二次清洗即可彻底出去残留在蛋白质中的三氯乙酸，最后再用去离子水反复冲洗。
[0017]8)将步骤1)中的初级饲料A与步骤7)中的
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N标记蛋白E按质量比4
‑
6∶1均匀捏合并在100
‑
105℃下蒸5
‑
15min，得到
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N同位素标记的桑蚕饲料F。
[0018]作为优选，步骤1)中，各原料的质量百分数为：桑叶粉45
‑
55％，脱脂豆饼粉20
‑
30％，甘薯粉10
‑
20％，柠檬酸0.1
‑
2％，维生素C 1
‑
3％，无机盐混合物0.1
‑
2％，没食子酸0.1
‑
0.5％，山梨酸0.1
‑
0.5％，氯霉素0.02
‑
0.06％，琼脂5
‑
15％。
[0019]作为优选，步骤2)中，
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N同位素标记的基础培养基的组分为：D
‑
葡萄糖45
‑
55g/L、亚硫酸铵
‑
15N 3
‑
7g/L、KH2PO
4 3
‑
7g/L。
[0020]作为优选，步骤2)中，培养时间为20
‑
30小时，培养温度为26～28℃。
[0021]作为优选，步骤3)中，冷冻干燥时间为40
‑
50h。
[0022]作为优选，步骤5)中，离心条件为：10000
‑
15000r/min，20
‑
40min。
[0023]作为优选，步骤6)中，真空干燥条件为：28
‑
32℃，40
‑
50h。
[0024]作为优选，步骤7)中，采用聚四氟乙烯膜过滤器进行过滤。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：本专利技术所制备的
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N同位素标记的桑蚕饲料标记效果好，且制备过程中无有毒副产物的产生，不会对家蚕产生任何的负面影响，对环境友好。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述。
[0027]实施例1
[0028]一种
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N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
[0029]1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A1；
[0030]2)将产朊假丝酵母在含有
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N标记的基础培养基(D...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种
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N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1) 将桑叶粉，脱脂豆饼粉，甘薯粉，柠檬酸，维生素C，无机盐混合物，没食子酸，山梨酸，氯霉素，琼脂均匀混合，得到初级饲料A；2) 将产朊假丝酵母在含有
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N同位素标记的基础培养基上培养；3) 将步骤2）所得培养产物离心收集细胞，水洗，液氮冷冻，最后冷冻干燥；4) 将步骤3)所得冷冻干燥产物研磨粉碎，按固液比50
‑
70g/L将所得粉末添加至8
‑
12%的三氯乙酸溶液中混合均匀，在98
‑
102℃下回流提取得到提取物B；5) 将步骤4)中所得提取物B离心处理，除去上层清液，得到离心产物C；6) 将步骤5)所得离心产物C用乙醇洗涤，然后进行真空干燥，得到干燥提取物D；7) 按固液比1：（6
‑
10）g/mL将步骤6)所得干燥提取物D添加至乙醇和氯仿体积比为1.5
‑
2.5:1的混合溶剂中，在85
‑
95℃下回流提取1
‑
2h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到
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N同位素标记蛋白E；8) 将步骤1)中的初级饲料A与步骤7)中的
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N标记蛋白E按质量比4
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6:1均匀捏合并在100
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105℃下蒸5
‑
15min，得到
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N同位素标记的桑蚕饲料F。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，各原料的质量百分数为：桑...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎浩，彭志勤，刘勇，杨丹，黄驹，夏润涛，张继超，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：