一种合成多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，且公开了一种合成多肽及其应用，根据hBD3的氨基酸序列通过Fmoc固相合成法合成L

【技术实现步骤摘要】
一种合成多肽及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体为一种合成多肽及其应用。

技术介绍

[0002]牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周组织的慢性感染性疾病，随着病情进展如果得不到及时有效的治疗便会面临失牙风险。要使已经破坏的牙周组织实现再生，抗炎、抗菌与组织修复重建同样重要。人β
‑
防御素3(humanβ
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defensin 3，hBD3)是一种具有广谱抗菌活性的阳离子抗菌肽，在人的牙龈、唾液腺等部位均有表达。hBD3可以调控内毒素刺激后巨噬细胞和上皮细胞的炎症反应，促进人牙周膜细胞成骨分化，并在一定程度上促进实验性牙周炎大鼠的局部牙周组织修复。自然界中及化学合成的不同手性构型材料(L
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构型/D
‑
构型)被证明具有功能的差异，且已有生物学和医学领域的相关应用。天然hBD3为L
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构型，在体内稳定性差，但研究表明D
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构型抗菌肽不易被体内酶识别，从而延长作用时间，而目前尚没有关于不同手性构型hBD3抗菌肽的研究。因此，本专利拟通过合成不同手性构型(L型和D型)的hBD3，之后进行抗菌，免疫调节和再生作用的研究，通过研究手性hBD3的功能，探索促进临床牙周治疗过程中组织修复再生的新方法。

技术实现思路

[0003](一)解决的技术问题
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种合成多肽及其应用，具备针对现有天然L型hBD3易被蛋白水解酶识别降解，从而作用时间有限的缺陷，首先通过将其组成L型氨基酸的手性结构均改变为D型氨基酸，之后通过化学方式合成D型hBD3，通过改变构型使其不易被蛋白水解酶识别，从而延长半衰期，增加作用时间等优点，解决了上述
技术介绍
中所提出的问题。
[0005](二)技术方案
[0006]本专利技术提供如下技术方案：一种合成多肽及其应用，根据hBD3的氨基酸序列通过Fmoc固相合成法合成L
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hBD3和D
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hBD3抗菌肽，并进行纯度和表征检测，之后将进行细胞毒性检测和蛋白酶稳定性检测。
[0007]优选的，所述L
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hBD3和D
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hBD3抗菌肽的纯度和表征检测采用图二色谱法和反相高效液相色谱法。
[0008]优选的，通过CCK
‑
8法检测不同浓度(0μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL)手性hBD3对RAW264.7和THP
‑
1的细胞增殖影响和细胞毒性作用。
[0009]优选的，蛋白水解酶稳定性实验：选用胰蛋白酶按照1:200000的摩尔比与手性hBD
‑
3在中性缓冲液中混合，37℃温育。在0,5,10,20和30分钟，1,2,4和8小时的时间点收集样品。将等体积的20％TFA水溶液加入到每个样品停止反应，通过RP
‑
HPLC检测抗菌肽的降解。
[0010]优选的，所述合成多肽的合成过程包括树脂溶涨、接第一个氨基酸、脱保护、检测、
洗、缩合、检测、洗、洗树脂、抽干、切割、吹干洗涤、氧化、纯化制备、冻干、鉴定和密封包装保存。
[0011]优选的，所述鉴定包括分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定和HPLC分析的纯度鉴定。
[0012]优选的，所述纯化制备包括以下步骤：
[0013]S1、取少许粗品，H2O/ACN溶解；
[0014]S2、取少量样品在HPLC分析仪器上进行分析判断目标峰对应出峰时间；
[0015]S3、利用C18反相色谱制备系统：Wavelength:220nm；Flow Rate:15ml/min；Inj.Vol:20mL Column Temp:25℃
[0016]Buffer A:0.1％TFA in water Buffer B:0.1％TFA in Acetonitrile；收集目标峰溶液；
[0017]S4、用1.5ml离心管取少许目标峰溶液进行质谱确认及纯度检测。
[0018]优选的，该合成多肽用于牙周炎进行抗菌，促进临床牙周治疗过程中组织修复再生。
[0019]与现有技术相比，本专利技术提供了一种合成多肽及其应用，具备以下有益效果：
[0020]1、该合成多肽及其应用，针对现有天然L型hBD3易被蛋白水解酶识别降解，从而作用时间有限的缺陷，首先通过将其组成L型氨基酸的手性结构均改变为D型氨基酸，之后通过化学方式合成D型hBD3，通过改变构型使其不易被蛋白水解酶识别，从而延长半衰期，增加作用时间，具有更广泛的应用价值。
[0021]2、该合成多肽及其应用，通过合成不同手性构型(L型和D型)的hBD3，之后进行抗菌，免疫调节和再生作用的研究，以期通过研究手性hBD3的功能，探索促进临床牙周治疗过程中组织修复再生的新方法。
附图说明
[0022]图1为本专利技术L
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hBD3结构示意图；
[0023]图2为本专利技术D
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hBD3结构示意图。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]请参阅图1
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2，一种合成多肽及其应用，根据hBD3的氨基酸序列通过Fmoc固相合成法合成L
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hBD3和D
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hBD3抗菌肽，并进行纯度和表征检测，之后将进行细胞毒性检测和蛋白酶稳定性检测，L
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hBD3和D
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hBD3抗菌肽的纯度和表征检测采用图二色谱法和反相高效液相色谱法，通过CCK
‑
8法检测不同浓度(0μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL)手性hBD3对RAW264.7和THP
‑
1的细胞增殖影响和细胞毒性作用，蛋白水解酶稳定性实验：选用胰蛋白酶按照1:200000的摩尔比与手性hBD
‑
3在中性缓冲液中混合，37℃温育。在0,5,10,20和30分钟，1,2,4和8小时的时间点收集样品。将等体积的20％TFA水溶液加入到每个样品停止反
应，通过RP
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HPLC检测抗菌肽的降解。
[0026]L
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hBD3(图1)和D
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hBD3(图2)的制作：采用Fmoc固相合成法进行两种多肽的合成，D
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hBD3首先要改性20种天然L型氨基酸为D型氨基酸。
[0027]其合成过程如下：
[0028]一、树脂溶涨
[0029]将2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成多肽，其特征在于：根据hBD3的氨基酸序列通过Fmoc固相合成法合成L
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hBD3和D
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hBD3抗菌肽，并进行纯度和表征检测，之后将进行细胞毒性检测和蛋白酶稳定性检测。2.根据权利要求1所述的一种合成多肽，其特征在于：所述L
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hBD3和D
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hBD3抗菌肽的纯度和表征检测采用图二色谱法和反相高效液相色谱法。3.根据权利要求1所述的一种合成多肽，其特征在于：通过CCK
‑
8法检测不同浓度(0μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL)手性hBD3对RAW264.7和THP
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1的细胞增殖影响和细胞毒性作用。4.根据权利要求1所述的一种合成多肽，其特征在于：蛋白水解酶稳定性实验：选用胰蛋白酶按照1:200000的摩尔比与手性hBD
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3在中性缓冲液中混合，37℃温育。在0,5,10,20和30分钟，1,2,4和8小时的时间点收集样品。将等体积的20％TFA水溶液加入到每个样品停止反应，通过RP
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【专利技术属性】
技术研发人员：李凌俊，闫福华，杨文荣，
申请(专利权)人：南京市口腔医院，
类型：发明
国别省市：