基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂及其定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂及其定量检测方法，基于固态纳米孔的酶催化反应介导的金纳米棒刻蚀法来检测H2O2，具体的是利用过氧化物酶催化H2O2，反应生成具有较强氧化性的羟基自由基对金纳米棒进行刻蚀，产物通过固态纳米孔时产生特征各异的过孔信号，通过对整个刻蚀过程进行纳米孔信号检测，实现了基于固态纳米孔的H2O2的高灵敏检测，特别是低浓度低样本条件下，H2O2的定量检测，属于纳米孔传感器检测领域。属于纳米孔传感器检测领域。属于纳米孔传感器检测领域。

【技术实现步骤摘要】
基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂及其定量检测方法


[0001]本专利技术提供了基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂及其定量检测方法，将H2O2的酶促反应介导的纳米颗粒的形貌变化和纳米孔传感技术结合，属于纳米孔传感器检测领域。

技术介绍

[0002]H2O2在化工、生物、制药、临床、环境和食品加工领域中都有广泛应用，其含量与分析鉴定对于工农业的持续发展以及环境安全具有重大的意义。特别在生物医学领域中，H2O2是一种重要的生化分子，参与细胞增殖，分化和迁移以及疾病发生相关的信号通路。正常生理条件下，细胞内H2O2的生理浓度非常低(10
‑8～10
‑6M)参与维持细胞内信号转导等各项功能(Nat Commun,2019,10,4526)。一旦异常，过高浓度的H2O2会诱导各种生物损害，导致衰老，癌症和中枢神经系统等疾病，如癌细胞中H2O2的浓度较正常细胞高约1
‑
2个数量级，因此对生理环境中H2O2进行准确灵敏的检测在生物医学领域具有十分重要的意义。
[0003]目前不同技术对H2O2的检测方法已经发展起来，主要包括比色法、荧光法、高效液相色谱法以及电化学方法等，其中比色法和电化学方法应用最多。然而，比色法存在样本量大、灵敏度较低问题，而电化学方涉及酶的固定以及载体电极材料严格，稳定性差等限制，难以满足目前环境安全、食品卫生，特别是生理环境下存在的H2O2的超低浓度，低成本，高通量的检测需求。因此本专利技术基于固态纳米孔传感开发一种简单操作，高灵敏的H2O2的定量检测试剂和方法。

技术实现思路

[0004]固态纳米孔具有无标记、高灵敏和低成本的优势，在单分子传感领域有重要的应用前景。在纳米孔传感检测中，单个分子穿过一个纳米量级的孔道会造成孔内电导的瞬间变化，形成可以检测的离子电流变化，通过分析离子电流信号的幅值和时间等特征信息，实现单分子水平的检测。不同于传统方法是对溶液环境中大量分子测量系综的平均行为的检测，纳米孔的高分辨率更能揭示单分子、单颗粒的动态变化以及局域环境中分子涨落等丰富的信息，同时该方法无需标记，装置简单，易于操作，样本量低，提供了一个高效的单分子传感平台。
[0005]基于上述纳米孔传感单分子检测平台，第一方面，本专利技术提出一种基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，所述试剂包括：具有类过氧化物酶活性的纳米酶或生物酶、贵金属纳米颗粒、十六烷基三甲基溴化铵CTAB和缓冲液；
[0006]其中，所述具有类过氧化物酶活性生物酶优选为辣根过氧化物酶HRP；进一步优选地，所述辣根过氧化物酶HRP的浓度范围1.0～5.0μM，最佳酶活性浓度为2μM,具有高的酶活性同时节约成本。
[0007]其中，具有类过氧化物酶活性的纳米酶包括类过氧化物酶，类氧化物酶，类过氧化
氢酶以及类超氧化物歧化酶纳米酶等纳米酶及其衍生物，可以对H2O2进行氧化还原分解。如Fe3O4纳米酶(ACS Biomaterials Science&Engineering,2021,7(1):299
‑
310)，铂纳米酶(ACS Nano,2021,15(3):5735
–
5751)及其他类似金属氧化物纳米材料及其衍生物(Analyst,2021,146(23):7284
‑
7293；Biomolecules,2021,11(7):1015)。
[0008]优选地，所用CTAB为1
‑
5mM，缓冲液为柠檬酸缓冲液(0.05M,pH 3.0
‑
5.0)或磷酸缓冲液(0.01M PBS，pH 3
‑
5.0),本专利技术优选柠檬酸缓冲液(0.05M,pH 4.0)，同时CTAB 2mM。
[0009]优选地，所述贵金属纳米颗粒为银纳米颗粒或金纳米颗粒中的任意一种或两种的组合，进一步优选金纳米颗粒。
[0010]进一步的，所述金纳米颗粒优选为棒状金纳米颗粒即金纳米棒，棒状金纳米颗粒相较于球状或立方结构的金纳米颗粒具有长径比高、结构各向异性明显、过孔信号信噪比高的优势，且所述固态纳米孔的孔径为孔径为20
‑
200nm，厚度为20
‑
100nm。
[0011]进一步优选的，为了保证刻蚀效果显著和纳米孔过孔信号的高信噪比以及颗粒刻蚀前后产生显著信号特征变化差异，所述棒状金纳米颗粒最佳长径比约为3：1，直径16
±
2nm，长度50
±
3nm。
[0012]优选地，所述贵金属纳米颗粒溶液中金纳米棒浓度范围为0.01
‑
1nM，该浓度的金棒在纳米孔中具有足够高的捕获率，捕获率≥1000个/min，同时利于酶促反应快速进行，节约成本，本专利技术优选金纳米棒浓度为0.2nM。
[0013]优选地，为了提高酶促反应效率，所述贵金属纳米颗粒与所述辣根过氧化氢酶的摩尔浓度比≥1000为佳，本专利技术优选摩尔浓度比为10000.
[0014]优选的，所述辣根过氧化物酶催化H2O2生成羟基自由基刻蚀金纳米棒的反应时间控制在20min左右，既能使刻蚀产生显著效果，又避免时间过长造成刻蚀产物耗尽。
[0015]优选的，当金纳米棒直径约16nm，长度约50nm，所选固态纳米孔最佳直径为60
‑
80nm，厚度为50nm，在纳米孔实验中可以获得高的信噪比，同时提高捕获率，减少颗粒堵孔现象的发生。
[0016]第二方面，本专利技术提供一种基于固态纳米孔传感器的过氧化氢定量检测标准曲线的绘制方法，所述方法包括：配置不同浓度梯度的H2O2溶液，其中包含浓度为零的H2O2溶液，分别加入上述检测试剂进行孵化，终止反应后使用纳米孔传感器对充分反应后的混合溶液进行检测，将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动溶液中刻蚀后的贵金属纳米颗粒通过纳米孔，将产生的贵金属纳米颗粒纳米孔离子电流信号进行统计，得到离子电流脉冲幅值的峰位变化值(ΔIp)与H2O2浓度之间的线性关系，并绘制标准曲线。
[0017]优选地，所述棒状金纳米颗粒长度为30～70nm；直径为15～20nm；长径比为2：1～4:1，长径比的调控依赖于硝酸银溶液与种子液的比例。
[0018]第三方面，本专利技术提供一种基于固态纳米孔传感器的过氧化氢定量检测方法，包括以下步骤：将待测样品加入制备的上述检测试剂进行酶促反应，然后将反应后的金纳米颗粒产物加入固态纳米孔传感器进行检测，在电压驱动下粒子过孔产生离子电流信号，统计其离子电流幅值的峰位变化值(ΔIp)，带入上述标准曲线，确定对应的样品中的H2O2浓度值，最终实现对样品中H2O2浓度的检测。
[0019]有益效果：
[0020]如图1所示，本专利技术所述基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂及其定量检
测方法，利用刻蚀技术将检测对象转化为纳米材料结构的变化，巧妙地利用了纳米孔高灵敏，高通量的特点；所述固态孔大小可控，性质稳定，选择性强，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，其特征在于，所述检测试剂适用于固态纳米孔传感器，所述检测试剂包括：具有类过氧化物酶活性的纳米酶或生物酶、贵金属纳米颗粒、CTAB和缓冲液。2.如权利要求1所述的基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，其特征在于，所述具有类过氧化物酶活性的纳米酶为辣根过氧化物酶。3.如权利要求2所述的基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，其特征在于，所述辣根过氧化物酶浓度范围1.0～5.0μM。4.如权利要求1所述的基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，其特征在于，所述CTAB浓度范围为1
‑
5mM，且所述缓冲液为柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，其中，柠檬酸缓冲液浓度为0.05M且pH值范围为3.0
‑
5.0，磷酸缓冲液浓度为0.01M且pH值范围为3
‑
5.0。5.如权利要求1所述的基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，其特征在于，所述贵金属纳米颗粒为银纳米颗粒或金纳米颗粒中的任意一种或两种的组合。6.如权利要求5所述的基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，其特征在于，所述贵金属纳米颗粒为金纳米颗粒。7.如权利要求6所述的基于固态纳米孔传感器的过氧化氢检测试剂，其特征在于，所述金纳米颗粒为棒状金纳米颗粒，所述固态纳米孔传感器中纳米孔的孔径为20
‑
200nm，厚度为20
‑
100nm。8.如权利要求7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：武灵芝，王润雨，曾祥杰，翁丽星，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：