一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，包括以下步骤：S1：Au NPs溶液的制备；S2：Au@4

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法


[0001]本专利技术涉及酶检测
，尤其是指一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶酶的方法。

技术介绍

[0002]透明质酸酶是一种内糖苷酶，可以特异性的降解透明质酸，透明质酸酶是Ⅰ型过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，研究报道各种肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，一些抗敏药物有强抑制透明质酸酶活性，因此抑制透明质酸酶活性作为研究抗过敏作用的指标。而透明质酸在细胞外基质中广泛存在，参与并影响了许多生理过程，如形态再生、伤口愈合、肿瘤侵袭等都与它息息相关，由于透明质酸的特殊性，透明质酸酶也与许多生理和病理过程有关。目前已经有许多资料显示，透明质酸酶在多种恶性肿瘤中会过表达。透明质酸酶与乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌等都有着千丝万缕的联系，其中与膀胱癌和前列腺癌关系最为密切。有研究表明，膀胱癌患者尿液中透明质酸酶水平是正常人的3
‑
7倍，透明质酸酶可以作为膀胱癌检测的标志物。因此开发一种能够应用于尿液中透明质酸酶的检测对膀胱癌患者的诊断和治疗至关重要。
[0003]透明质酸酶可以特异性的将透明质酸分解成小片段，透明质酸(HA)是一种由N
‑
乙酰基
‑
D
‑
葡糖胺和β
‑
葡糖醛酸组成的双糖单元重复连接而成的一种高分子量的线性多糖。针对这一特性，已经开发出许多检测透明质酸酶活性的方法，如比浊法、粘度法和酶谱法，这几种方法虽然操作简便，但选择性和灵敏度较差，针对这些缺点，又开发了荧光光谱法、比色法、免疫测定法等，虽然比起传统方法选择性和灵敏度得到较大提高，但仍存在许多不足。比如目前采用荧光光谱法检测透明质酸酶活性时通常采用单波长发射，这就使得对外界环境要求较高，温度浓度等都会对实验产生较大影响，而温度对酶活性影响较大，实验结果容易产生误差。而免疫测定法所需成本较高，对操作过程和操作人员要求较高。因此，需要开发一种操作简便，灵敏度高，选择性好的透明质酸酶(HAase)检测方法。表面增强拉曼散射(SERS)作为一种超灵敏的分析技术已经被应用在许多领域内。与荧光和比色分析方法相比， SERS具有抗光漂白性、非侵入性等优点，这些在生物医学检测方面有着很大优势。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是：目前针对透明质酸酶活性的检测方法普遍存在选择性和灵敏度较差等缺点，本专利技术提供了一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，通过设计“Au@4
‑
MPBA@HA/Fe3O4@DTNB@Au@MEA”“核卫星”结构纳米探针对透明质酸酶活性进行了检测，提高了对透明质酸酶活性的检测灵敏度。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，包括以下步骤：
[0007]S1：Au NPs溶液的制备；
[0008]S2：Au@4
‑
MPBA@HA NPs溶液的制备；
[0009]S3：Fe3O4@DTNB@Au@MEA基底的制备；
[0010]S4：Au@4
‑
MPBA@HA/Fe3O4@DTNB@Au@MEA复合物溶液的制备；
[0011]S5：HAase的检测。
[0012]进一步的，所述S1 Au NPs溶液的制备方法：在强烈搅拌条件下，将1％ wt的Nact溶液和0.01％wt的HAuCl4溶液沸腾水溶液以体积比1:50混合；当溶液再次沸腾后继续加热搅拌15分钟，得到呈酒红色的Au NPs溶液。
[0013]进一步的，所述S2 Au@4
‑
MPBA@HA NPs溶液的制备方法：将纯化后的 Au NPs溶液与1mM的4
‑
巯基苯硼酸溶液以体积比(200:1
‑
100:1)混合，孵化2h后，离心并重悬于蒸馏水中；将1mg/mL的HA溶液以体积比(20:1
‑
10:1) 加入重悬后的溶液中，搅拌2h，得到Au@4
‑
MPBA@HA NPs溶液。
[0014]进一步的，所述S2中离心的条件为转速8500rpm，时间12min。
[0015]进一步的，所述S3 Fe3O4@DTNB@Au@MEA基底的制备方法：将1g的 Fe3O4经过1mg/mL的PEI处理后与金种子溶液一起孵育30min，得到的 Fe3O4@Au
‑
seed NPs溶液；将Fe3O4@Au
‑
seed NPs溶液利用磁铁分离并洗涤重悬后再与0.1mM的DTNB以体积比(80:1
‑
120:1)混合孵育30min；孵育后再次利用磁铁分离并洗涤，并重悬在去离子水中得到Fe3O4@Au
‑
seed@DTNBNPs溶液，将其放置于3mg/mL的PVP和0.5mg/mL的盐酸羟胺混合溶液中，前者与后者的体积比为(1:15
‑
1:20)超声15min，然后向其中加入100
‑
500 μL的1％wt的氯金酸溶液超声15min。
[0016]进一步的，所述S4 Au@4
‑
MPBA@HA/Fe3O4@DTNB@Au@MEA复合物溶液的修饰制备方法：将S2制得的Au@4
‑
MPBA@HA NPs溶液中透明质酸表面的羧基活化后，与S3制得的Fe3O4@DTNB@Au@MEA基底溶液孵育2h，得到Au@4
‑
MPBA@HA/Fe3O4@DTNB@Au@MEA复合物溶液A，复合物溶液A利用磁铁分离并洗涤重悬后，与5％wt的牛血清白蛋白以体积比10:1混合并孵育1h，得到Au@4
‑
MPBA@HA/Fe3O4@DTNB@Au@MEA复合物溶液。
[0017]进一步的，所述S4中的Au@4
‑
MPBA@HA NPs溶液中透明质酸表面羧基活化方法：将20mg/ml的1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和 20mg/ml的N
‑
羟基琥珀酰亚胺以体积比1:4加入Au@4
‑
MPBA@HA NPs溶液，搅拌30min。
[0018]进一步的，所述S4中复合物溶液A的孵育比例：Au@4
‑
MPBA@HA NPs 与Fe3O4@DTNB@Au@MEA以体积比(1:1
‑
6:1)混合孵育。
[0019]进一步的，所示S5 HAase的检测方法：将不同活性的透明质酸酶加入S4 制得的Au@4
‑
MPBA@HA/Fe3O4@DTNB@Au@MEA复合物溶液中，孵育0
‑
150min，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息，拉曼光谱仪的激发波长为 785nm，通过拉曼光谱处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：Au NPs溶液的制备；S2：Au@4
‑
MPBA@HA NPs溶液的制备；S3：Fe3O4@DTNB@Au@MEA基底的制备；S4：Au@4
‑
MPBA@HA/Fe3O4@DTNB@Au@MEA复合物溶液的制备；S5：HAase的检测。2.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，其特征在于，所述Au NPs溶液的制备方法如下：在强烈搅拌条件下，将1％wt的Nact溶液和0.01％wt的HAuCl4溶液沸腾水溶液以体积比1:50混合；当溶液再次沸腾后继续加热搅拌15分钟，得到呈酒红色的Au NPs溶液。3.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，其特征在于，所述Au@4
‑
MPBA@HANPs溶液的制备方法如下：将纯化后的Au NPs溶液与1mM的4
‑
巯基苯硼酸溶液以体积比(200:1
‑
100:1)混合，孵化2h后，离心并重悬于蒸馏水中；将1mg/mL的HA溶液以体积比(20:1
‑
10:1)加入重悬后的溶液中，搅拌2h，得到Au@4
‑
MPBA@HANPs溶液。4.根据权利要求3所述的一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，其特征在于，所述离心的条件为转速8500rpm，时间12min。5.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，其特征在于，所述Fe3O4@DTNB@Au@MEA基底的制备方法如下：将1g的Fe3O4经过1mg/mL的PEI处理后与金种子溶液一起孵育30min，得到的Fe3O4@Au
‑
seed NPs溶液；将Fe3O4@Au
‑
seed NPs溶液利用磁铁分离并洗涤重悬后再与0.1mM的DTNB以体积比(80:1
‑
120:1)混合孵育30min；孵育后再次利用磁铁分离并洗涤，并重悬在去离子水中得到Fe3O4@Au
‑
seed@DTNB NPs溶液，将其放置于3mg/mL的PVP和0.5mg/mL的盐酸羟胺混合溶液中，前者与后者的体积比为1:15
‑
1:20，超声15min，然后向其中加入100
‑
500μL的1％wt的氯金酸溶液超声15min。6.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼技术检测透明质酸酶的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，卢玉栋，黄嘉莉，游瑞云，吴阳，沈慧英，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：