一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法，所述方法首先计算同一对夫妇所有胚胎的基因型，但是仅挑选在所有胚胎中扩增度均较高的区域中的基因型位点，并从中挑选出可用于区分父母源的SNP位点。并通过孟德尔遗传定律，得到每个胚胎的单体型，由于挑选高扩增区域位点，得到的基因型和单体型更加准确，进一步通过隐马尔可夫模型精炼胚胎的单体型，提高所鉴定的二倍体胚胎细胞单体型的准确性。的准确性。的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法及应用


[0001]本专利技术涉及遗传学检测领域，更为具体的，本专利技术涉及一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法及应用。

技术介绍

[0002]在胚胎着床前遗传学检测（Preimplantation genetic testing，PGT）过程中，一般使用单体型进行连锁分析诊断胚胎是否携带致病突变，但是染色体交叉互换会极大影响单体型诊断的准确性，造成错误诊断。因此，鉴定胚胎中染色体交叉互换位置，对于准确诊断十分重要。然而目前没有一个较好的鉴定二倍体胚胎中染色体交叉互换位置的方法。本专利技术的目的是开发一种通过二代测序数据，鉴定二倍体胚胎中染色体交叉互换位置的计算方法。
[0003]基本方法是首先得到少量活检胚胎细胞并扩增DNA，而后对扩增后DNA进行测序，得到二代测序数据。之后通过二代测序数据得到每个胚胎的基因型。通过孟德尔遗传定律，得到每个胚胎的初始单体型，而后通过不同胚胎的单体型的相互比较，结合隐马尔可夫模型，得到每个胚胎中的父母源染色体交叉互换位置。
[0004]对于二倍体的胚胎细胞，在鉴定其中的染色体交叉互换之前，需要先确定胚胎的基因型并进一步确定胚胎的父源及母源单体型，而后才能进行交叉互换位置的计算。由于在实际诊断过程中，胚胎活检所得细胞量十分稀少，往往只有3
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5个细胞，需要先进行单细胞DNA扩增得到扩增后DNA，而后进行建库测序，得到胚胎基因型。之后才可以通过基因型得到单体型，并通过单体型计算染色体交叉互换位置。在二倍体胚胎细胞DNA扩增过程中，由于目前单细胞DNA扩增方法的限制，会导致二倍体的染色体在基因组中的随机位置，其中一方染色体序列扩增失败，只有另一方染色体序列扩增成功，从而导致得到的二倍体胚胎基因型包含大量序列错误，对后续鉴定交叉互换位置造成极大影响。这种现象称之为“脱扣”。例如，胚胎在某个位置的基因型为“AT”，但是经过扩增后，只有“A”碱基扩增成功而另一方的“T”碱基扩增失败，导致得到的基因型为“AA”，从而对后续构建单体型并进一步计算交叉互换位置造成极大干扰。
[0005]单倍体的精子和卵细胞由于只有一方的染色体，在DNA扩增过程中，不存在扩增“脱扣”现象，因此基因型鉴定相对二倍体更加准确，无需矫正由于“脱扣”造成的错误。这导致鉴定单倍体精子和卵细胞中染色体交叉互换位置的方法无法直接应用于二倍体的胚胎细胞。目前鉴定单倍体生殖细胞中染色体交叉互换位置的方法主要存在两个缺陷：一是由于不涉及DNA扩增“脱扣”现象，没有涉及处理扩增后碱基错误的方面；二是该方法只适用于鉴定单倍体生殖细胞中染色体的交叉互换位置，无法直接应用于二倍体的胚胎细胞。因此，迫切需要开发一种可准确鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术中存在的障碍，本专利技术提供一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法及其应用，具体的，本专利技术提供如下的技术方案：本专利技术的第一个方面，提供一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法，所述方法包括如下步骤：（1）将胚胎活检细胞、丈夫gDNA、妻子gDNA、患儿gDNA进行单细胞DNA扩增；（2）将扩增后的DNA进行建库及二代测序，得到每个样本的二代测序reads数据；（3）所得测序reads，去除接头序列、低质量碱基后，比对至人类参考基因组，得到唯一比对的去重复后reads，并鉴定染色体每个位置的基因型；（4）对于该家系所有测序样本，进行如下过滤，得到更加准确的基因型：（a）仅保留父源或母源为杂合的基因型位点，但是不要求父源或母源同时为杂合；（b）由于MALBAC扩增方式在基因组中不同区域具有非均一性，但是在不同样本的同一区域具有重复性，因此进一步保留>1/2样本中有覆盖的位点，这些位点相对于未过滤位点，具有更高的基因分型准确性；（c）对于每个样本中的基因型，仅保留覆盖度大于5的位点，其他位点转换为NA。经过该过滤条件，可以很好地提高所得基因型的准确性。
[0007]（5）对于过滤后所得基因型，使用孟德尔分离定律，对子代样本（包括先证儿、所有胚胎）所有位点进行定相（phase），将每个基因型的碱基区分为父源来源和母源来源。至此，每个子代的所有基因型被分为了两份，一份为父源单体型，一份为母源单体型。
[0008]（6）得到子代父源及母源单体型后，对于每一个特定的子代样本i，首先确定父源单体型上的交叉互换位置，具体为：（a）将子代i的父源单体型作为参照（下述观测矩阵第1列），同所有其他子代的父源单体型进行比较，碱基相同标记为1，碱基不同标记为0，得到mn的矩阵，其中m表示子代i所有测定所得单体型位点，n表示子代样本个数。得到如下的观测矩阵：（b）对于矩阵的每一列j（2≤j≤n），使用隐马尔可夫模型，推断每个位点k（1≤k≤m）的真实状态（0或1）。具体地，对于每一个位点的转移概率，规定如下：即上一状态为1且下一状态也为1（或上一状态为0且下一状态为0）的概率为0.9999，上一状态为1而下一状态为0（或上一状态为0而下一状态为1）的概率为0.0001。
[0009]（c）对于染色体上每一个位点k的观测概率定为，即在真实状态为S（State）的情况下，得到观测状态O（Observation）的概率。观测概率矩阵为：
即在真实状态为1的状态下观测到1（或真实状态为0观测到0）的概率为0.9。在真实状态为1的状态下观测到0（或真实状态为0观测到1）的概率为0.1。
[0010]（d）初始状态概率矩阵为：即初始情况下，真实状态为1的概率P(S=1)=0.5，真实状态为0的概率P(S=0)=0.5。
[0011]（e）通过以上概率矩阵及隐马尔可夫模型，得到每一列j的最大似然估计计算公式为：（f）通过Viterbi动态规划算法，得到最大概率所对应的真实状态。
[0012]对于该家系，矫正后所得的真实状态矩阵为：（g）对于矩阵每一列，显示所有样本均在k（此处示例为k=3）位置状态发生了转换，从连续的1转为0，或从连续的0转为1，表明实际上是位于最左侧的样本i在k位置发生了交叉互换。最后，对结果进行可视化展示。
[0013]在一种实施方式中，进一步包括使用相同的方式确定母源单体型上的交叉互换位置。
[0014]在一种实施方式中，所述步骤（1）使用MALBAC方法进行单细胞DNA扩增。
[0015]在一种实施方式中，所述步骤（3）为所得测序reads，使用trim_galore去除接头序列、低质量碱基。保留长度大于36bp的测序reads。处理后reads使用bwa默认参数比对至人类参考基因组。进一步去除低比对质量序列和PCR重复序列，得到唯一比对的去重复后reads。过滤后的比对reads使用GATK best practice鉴定染色体每个位置的基因型。
[0016]本专利技术相对于现有技术获得了如下突出的进步：1. 提高所鉴定的二倍体胚胎细胞基因型的准确性，从而使用更加准确的基因型构建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法，所述方法包括如下步骤：（1）将胚胎活检细胞、丈夫gDNA、妻子gDNA、患儿gDNA进行单细胞DNA扩增；（2）将扩增后的DNA进行建库及二代测序，得到每个样本的二代测序reads数据；（3）所得测序reads，去除接头序列、低质量碱基后，比对至人类参考基因组，得到唯一比对的去重复后reads，并鉴定染色体每个位置的基因型；（4）对于该家系所有测序样本，进行如下过滤，得到更加准确的基因型：（a）仅保留父源或母源为杂合的基因型位点，但是不要求父源或母源同时为杂合；（b）由于MALBAC扩增方式在基因组中不同区域具有非均一性，但是在不同样本的同一区域具有重复性，因此进一步保留>1/2样本中有覆盖的位点，这些位点相对于未过滤位点，具有更高的基因分型准确性；（c）对于每个样本中的基因型，仅保留覆盖度大于5的位点，其他位点转换为NA，经过该过滤条件，可以很好地提高所得基因型的准确性，（5）对于过滤后所得基因型，使用孟德尔分离定律，对子代样本（包括先证儿、所有胚胎）所有位点进行定相（phase），将每个基因型的碱基区分为父源来源和母源来源，至此，每个子代的所有基因型被分为了两份，一份为父源单体型，一份为母源单体型，（6）得到子代父源及母源单体型后，对于每一个特定的子代样本i，首先确定父源单体型上的交叉互换位置，具体为：（a）将子代i的父源单体型作为参照（下述观测矩阵第1列），同所有其他子代的父源单体型进行比较，碱基相同标记为1，碱基不同标记为0，得到m
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n的矩阵，其中m表示子代i所有测定所得单体型位点，n表示子代样本个数，得到如下的观测矩阵：（b）对于矩阵的每一列j（2≤j≤n），使用隐马尔可夫模型，推断每个位点k（1≤k≤m）的真实状态（0或1），具体地，对于每一个位点的转移概率，规...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔杰，严智强，宋石，闫丽盈，张春梅，孔菲，朱小辉，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：