一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，采用RNA干扰(RNAi)降低柑橘属植物中CsWRKY43的转录水平，其中，CsWRKY43编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段；(2)构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体；(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。本发明专利技术通过克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段，构建干扰载体，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病病斑面积可最大降低至现有柑橘的64％，病情指数可最大降低至现有柑橘的61％，能够显著的减轻溃疡病的发病程度。程度。程度。

【技术实现步骤摘要】
一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法。

技术介绍

[0002]近年来，我国柑橘产业发展迅猛，逐渐成为南方山区的主要经济支柱。然而，柑橘产业发展却饱受柑橘溃疡病等病害的制约。柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.Citri，Xcc)引起的细菌性病害，其危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。
[0003]柑橘溃疡病的传统防控手段(病树焚烧和农药使用等)需要投入大量人力和物力，且会造成巨大环境危害。因此，柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。分子育种由于可定向、高效培育抗病新种质，目前得到快速发展和广泛应用。近年来，通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病的柑橘资源，例如转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系；过表达CsBZIP40的晚锦橙株系；基因定点编辑柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子获得的对柑橘溃疡病抗性提高的植株等。但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，致使多基因协同对抗溃疡病还难以实现，制约了柑橘抗溃疡病分子育种的发展。因此，亟待有针对性地挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关的基因，深入解析其功能和机制，用于抗溃疡病分子育种。
[0004]自1996年WRKY转录因子被首次报道在应对病原体方面发挥一定的调控作用以来，越来越多的研究聚焦于WRKY转录因子在植物抗病中的功能。不同的WRKY转录因子在植物免疫防御反应中功能各异。利用WRKY基因进行抗病分子育种具有重大的潜力。但是，植物WRKY转录因子家族成员众多，而且各成员的功能和机制也多种多样，利用WRKY进行抗病分子育种的尝试还不多，尚没有利用RNAi介导的WRKY沉默提高柑橘对柑橘溃疡病的抗性研究和应用。
[0005]研究中发现，受Xcc诱导后CsWRKY43在感病品种晚锦橙中表达量总体呈上升趋势，与之相反，在抗病品种四季橘中CsWRKY43的表达量呈下降趋势，暗示CsWRKY43是溃疡病的一个感病基因。CsWRKY43可以通过正调控下游的活性氧清除相关基因的表达降低植株的活性氧水平，活性氧在植物抗病过程中有积极的调控作用，所以推测CsWRKY43干扰可能降低活性氧清除相关基因的表达进而增加植株的活性氧水平和溃疡病抗性。
[0006]有鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

[0007]本专利技术为提高柑橘对溃疡病的抗性，提供一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，该方法通过将CsWRKY43编码基因的干扰载体整合到柑橘中，降低CsWRKY43的转录水平，能够显著提高柑橘对溃疡病的抗性，并且不影响转基因植株的表型。
[0008]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0009]一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，所述方法为采用RNA干扰(RNAi)降低柑橘属植物中CsWRKY43的转录水平，其中，CsWRKY43编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体包括以下步骤：
[0010](1)克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段；
[0011](2)构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体；
[0012](3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。
[0013]步骤(1)中，柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用高保真酶PCR扩增得到CsWRKY43编码基因的RNAi片段，所述RNAi片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；PCR扩增所采用的引物为CsWRKY43
‑
RNAi
‑
F和CsWRKY43
‑
RNAi
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
[0014]步骤(2)中，干扰载体构建方法为：(2.1)将步骤(1)中获得的PCR产物CsWRKY43编码基因的RNAi片段分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；(2.2)将酶切回收的两组片段同时连接到pUC
‑
RNAi载体，得到中间载体pUC
‑
RNAi
‑
CsWRKY43；(2.3)将中间载体pUC
‑
RNAi
‑
CsWRKY43和pLGNe超量表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切；(2.4)将中间载体含有RNAi片段的酶切产物连接到pLGNe载体上；(2.5)连接转化至感受态细胞，提取质粒，得到干扰表达载体pLGNe
‑
CsWRKY43
‑
RNAi。
[0015]步骤(3)中，干扰表达载体转化柑橘的方法为：通过电击法将干扰表达载体质粒导入农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞再经离体培养、染色鉴定、嫁接、PCR验证和qRT
‑
PCR验证后得到转基因植株。
[0016]另一种具体实施方式，步骤(2)得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsWRKY43干扰与柑橘溃疡病抗性的相关性。
[0017]另一种具体实施方式，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID
‑
CsWRKY43
‑
F和ID
‑
CsWRKY43
‑
R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0018]另一种具体实施方式，PCR验证后，用qRT
‑
PCR验证转基因植株中CsWRKY43的转录水平，目的基因检测采用的引物为RT
‑
CsWRKY43
‑
F和RT
‑
CsWRKY43
‑
R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0019]本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
[0020]1、本专利技术实施例提供的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，从柑橘感染溃疡病前后差异表达的基因中获得了一个在抗病品种中受柑橘溃疡病菌诱导下调、在感病品种中上调的转录因子CsWRKY43，通过构建CsWRKY43编码基因的干扰载体，根癌农杆菌介导转化柑橘后，能够对柑橘溃疡病表现出明显抗性；
[0021]2、本专利技术实施例提供的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，通过克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段，构建干扰载体，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病病斑面积可最大降低至现有柑橘的64％，病情指数可最大降低至现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述方法为降低柑橘属植物中CsWRKY43的转录水平，其中，CsWRKY43编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，降低柑橘属植物中CsWRKY43转录水平的方式采用RNA干扰(RNAi)。3.根据权利要求2所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段；(2)构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体；(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。4.根据权利要求3所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用高保真酶PCR扩增得到CsWRKY43编码基因的RNAi片段，所述RNAi片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。5.根据权利要求3所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增所采用的引物为CsWRKY43
‑
RNAi
‑
F和CsWRKY43
‑
RNAi
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。6.根据权利要求3所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(2)中，干扰载体构建方法为：(2.1)将步骤(1)中获得的PCR产物CsWRKY43编码基因的RNAi片段分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；(2.2)将酶切回收的两组片段同时连接到pUC
‑
RNAi载体，得到中间载体pUC
‑
RNAi
‑
CsW...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，喻奇缘，秦秀娟，傅佳，何永睿，陈善春，龙琴，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：