一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物制药工程技术领域。所述抗菌肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明专利技术通过柔性肽链，将人锌铜超氧化物歧化酶的两端与抗菌肽CecropinB融合，设计出一种抗菌肽融合蛋白Cb

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物制药工程
，特别是涉及一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]好氧型生物在新陈代谢的反应过程中，分子氧的不完全还原导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的不断产生，包括过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO
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)和超氧阴离子自由基(O2‑
)等。ROS过度累积会导致氧化应激，损害DNA、使蛋白质失活、细胞膜脂过氧化，严重时导致细胞功能紊乱甚至癌变、凋亡。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1)是一种广泛存在的天然抗氧化剂，其作为抗氧化防御系统中最关键的组成部分，是消除ROS的第一道防线。SOD能够促进超氧阴离子自由基的歧化反应，将O2‑
降解为过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，抗坏血酸和过氧化氢酶随后将H2O2分解为H2O和O2，从而清除O2‑
，维持生物体内ROS产生与消除的动态平衡，在维持细胞氧化和还原平衡方面起着重要作用。根据辅助因子的不同，超氧化物歧化酶主要分为铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn
‑
SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe
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SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn
‑
SOD)与镍超氧化物歧化酶(Ni
‑
SOD)，但哺乳类动物体内仅含有Cu/Zn
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SOD与Mn
‑
SOD。目前，铜锌超氧化物歧化酶因其具有较高的比活性(>10000IU/mg)而广泛应用于医疗及护肤品领域。然而，目前蛋白类产品在储存环节需要额外的添加防腐剂以保证其稳定性。
[0003]抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有抗菌活性的多肽，通常由20～60个氨基酸残基组成，通常因富含精氨酸而成碱性，具有广谱抗菌、抗菌效率高、热稳定性高等特点，广泛存在于动植物和细菌等微生物内。抗菌肽通过与细菌的细胞膜结合，形成孔隙使其可渗透来选择性杀灭细菌。因此不涉及任何特定的靶标蛋白质，不易产生细菌耐药性，且对已产生耐药性的菌株也有效，是一种理想的抗生素替代物。然后抗菌肽本身又存在着较难表达或合成导致的生产成本高，以及本身带有多个正电荷难以配伍使用等问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该融合蛋白既有抗氧化活性，又具有抗菌活性。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种抗菌肽融合蛋白，所述抗菌肽融合蛋白由一个SOD蛋白和两个抗菌肽CecropinB构成，所述SOD蛋白的两端通过柔性肽段与抗菌肽CecropinB连接。
[0007]进一步地，所述抗菌肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]本专利技术还提供一种编码上述的抗菌肽融合蛋白的基因序列，所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]本专利技术还提供一种重组表达载体，包含上述的基因序列。
[0010]本专利技术还提供一种重组菌株，包含上述的基因序列或重组表达载体。
[0011]本专利技术还提供一种上述的抗菌肽融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)将如SEQ ID NO.4所示的基因序列在宿主细胞中进行包涵体形式表达，得到包涵体蛋白；
[0013](2)所述包涵体蛋白经洗杂，溶解，复性后，得到所述抗菌肽融合蛋白。
[0014]进一步地，在步骤(2)中，所述洗杂的具体操作包括：用洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III依次洗涤所述包涵体蛋白；所述洗涤液I为：50mM Tris
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HCl，10mM EDTA，5％甘油，1％Triton X
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100，100mMβ
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巯基乙醇，pH 8.0；所述洗涤液II为：所述洗涤液I+0.3M Urea；所述洗涤液III为：所述洗涤液I+0.6M Urea。
[0015]进一步地，在步骤(2)中，所述溶解的具体操作包括：将洗杂后的包涵体蛋白加入纯水混匀后，再加入尿素溶液进行变性处理。
[0016]本专利技术还提供上述的抗菌肽融合蛋白在制备抗菌抗氧化的产品中的应用。
[0017]进一步地所述产品为抗菌药物或美容护肤品。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]本专利技术通过设计合理的柔性肽链，将人锌铜超氧化物歧化酶的两端与抗菌肽CecropinB融合，设计出一种抗菌肽融合蛋白Cb
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SOD
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Cb。该抗菌肽融合蛋白既有抗氧化活性，又具有抗菌活性，可用于抗菌药物及美容护肤品的制备中。
[0020]本专利技术在宿主细胞内高效表达抗菌肽融合蛋白Cb
‑
SOD
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Cb，先采用包涵体表达，避免了可溶性表达产生的重组蛋白对宿主造成的伤害，并采用包涵体清洗除杂及变复性技术制备了兼具有抗菌活性及抗氧化性的重组蛋白，本专利技术方法可以简单、快速、高效制备具有多功能性的融合蛋白。为酶的保存，以及无防腐体系应用拓展提供一条崭新的径。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为Cb
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SOD
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Cb融合蛋白结构示意图；
[0023]图2为Cb
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SOD
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Cb融合蛋白结构预测图；其中绿色：SOD，蓝色：linker，红色：CecropinB；
[0024]图3为重组载体pET26
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Cb
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SOD
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Cb的示意图；
[0025]图4为Cb
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SOD
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Cb蛋白及重组菌破碎沉淀SDS
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PAGE图；其中M：标准分子量marker，1：复性后的重组Cb
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SOD
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Cb蛋白(0.5mg/mL)，2：复性后的重组Cb
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SOD
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Cb蛋白(0.5mg/mL)，3：重组菌破碎后离心获得的沉淀物(含Cb
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SOD
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Cb包涵体)；
[0026]图5为Cb
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SOD
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Cb蛋白抑菌图；其中A为金黄色普通球菌，B为大肠杆菌；A和B中，0：PBS对照，1：卡那霉素0.5mg/mL，2：Cb
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SOD
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Cb蛋白1mg/mL，3Cb本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽融合蛋白，其特征在于，所述抗菌肽融合蛋白由一个SOD蛋白和两个抗菌肽CecropinB构成，所述SOD蛋白的两端通过柔性肽段与抗菌肽CecropinB连接。2.根据权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白，其特征在于，所述抗菌肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。3.一种编码权利要求2所述的抗菌肽融合蛋白的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求3所述的基因序列。5.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的基因序列或权利要求4所述的重组表达载体。6.一种如权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将如SEQ ID NO.4所示的基因序列在宿主细胞中进行包涵体形式表达，得到包涵体蛋白；(2)所述包涵体蛋白经洗杂，溶解，复性后，得到所述抗菌肽融合蛋白。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：王坚，汤国霞，陈增妙，吴旭萍，王伊宁，赵锐峰，
申请(专利权)人：杭州华玮生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：