一种免PAM序列的DNA分子机器用于检测新冠病毒的方法和应用技术

本发明专利技术属于分子诊断技术领域，具体为一种免PAM序列的DNA分子机器。基于该DNA分子机器与CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种免PAM序列的DNA分子机器用于检测新冠病毒的方法和应用


[0001]本专利技术属于分子诊断
，具体为一种免PAM序列的DNA分子机器。基于该DNA 分子机器与CRISPR
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Cas12a耦合构建了一个名为PfTSDR
‑
CRISPR检测SARS
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CoV
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2的方法 及其应用。

技术介绍

[0002]急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2)已经开发出对应的疫苗，但鉴于疫苗的有效 性和SARS
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COV
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2的快速突变，例如：Omicron/Delta/Alpha。目前对SARS
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COV
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2进行特异 和敏感的早期检测仍然是控制COVID
‑
19传播和监测治疗的有效方法。因此，开发特异且灵 敏的SARS
‑
CoV
‑
2检测方法具有十分重要的意义。
[0003]与抗体和抗原检测相比，核酸检测灵敏度高，不易引起假阴性诊断。因此，核酸检测可 以为COVID
‑
19的诊断提供更有效的信息。检测SARS
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CoV
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2靶标基因组的金标准方法称为 实时逆转录聚合酶链反应(qRT
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PCR)，它直接量化SARS
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CoV
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2靶标基因组。然而，qRT PCR 需要热循环、复杂的方案和昂贵的仪器，不适用于小型诊所或社区卫生设施。成簇规律间隔 短回文重复序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其有关 的功能蛋白质(CRISPR
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associatedprotein，Cas蛋白)被称为CRISPR
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Cas系统。近年来，该 系统在构建等温核酸诊断系统方面引发了一场技术革命。在这些核酸诊断系统中，大多数依 赖于蛋白质的反式切割活性，例如SHERLOCK(Cas13a)、DETECTR(Cas12a)和 Cas14
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DETECTR(Cas14)等。CRISPR
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Cas12a系统能够特异性切割双链DNA(dsDNA)底 物或单链DNA(ssDNA)底物，然后在导向RNA(gRNA)的帮助下反式切割任何单链DNA (ssDNA)。由于被双链DNA底物激活的Cas12a具有比单链DNA底物更有效的反式切割活 性，大多数研究人员使用dsDNA作为激活底物。为了避免dsDNA底物对PAM序列的依赖 性，湖南大学聂舟课题组报告了一种免PAM序列的CRISPR
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Cas12a系统，其主要将作为 dsDNA底物设计具有气泡结构，同时该气泡结构位于CRISPR
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Cas12a系统识别的种子区。然 而，该方法能否应用于电化学生物传感器，并与等温信号放大相结合，构建一个高灵敏度的 检测系统仍有待探索。
[0004]DNA分子机器是当双链中较短的单链DNA或RNA在一个未配对区域(toehold)的协 助下被侵入时，就会发生toehold介导的链置换反应(TSDR)。通过设计级联的TSDR，能够 在不使用任何酶的情况下实现靶循环扩增，避免了复杂的引物设计、严格的实验条件和高成 本的问题。但以往报道的利用DNA分子机器产生dsDNA激活底物与CRISPR
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Cas12a耦合， 均需要PAM序列的帮助。
[0005]因此，迫切需要开发一种基于无PAM级联TSDR和CRISPR
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Cas12a的电化学生物传感 器来检测SARS
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CoV
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2。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种免PAM序列的DNA分子机器。基于 该DNA分子机器与CRISPR
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Cas12a耦合构建了一个名为PfTSDR
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CRISPR检测SARS
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CoV
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2 的方法及其应用。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008]一种免PAM序列的DNA分子机器，所述DNA分子机器的制备方法包括将 DNA1/DNA2/DNA3探针、SARS
‑
CoV
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2的RdRp基因与燃料探针经级联级联toehold介导的 链置换反应(TSDR)获得；
[0009]所述DNA1/DNA2/DNA3探针为DNA1、DNA 2和DNA3形成的探针，序列分别如 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述燃料探针的序列如SEQ ID NO.5所 示。
[0010]进一步的，所述DNA1/DNA2/DNA3探针的制备方法包括：将DNA1、DNA2和DNA 3 的混合物在95℃下退火5分钟，并缓慢冷却获得。
[0011]进一步的，所述级联TSDR使用的缓冲液为、PBS或HEPES缓冲液。
[0012]进一步的，所述级联TSDR使用了不同浓度的所述SARS
‑
CoV
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2的RdRp基因，所述 SARS
‑
CoV
‑
2的RdRp基因的浓度范围为100aM
‑
10pM。
[0013]进一步的，所述DNA1、DNA 2和DNA 3探针的摩尔比为1：1
‑
1.5：1
‑
2，优选为1：1： 1。
[0014]优选的，所述DNA分子机器的制备方法具体包括：将DNA1(5.0μM)、DNA 2(5.0μM) 和DNA 3(5.0μM)的混合物在95℃下退火5分钟，并缓慢冷却至室温以形成 DNA1/DNA2/DNA3复合物。然后，将不同浓度的SARS
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CoV
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2RdRp基因与1.0μM DNA1/DNA2/DNA3复合物和燃料在37℃的Tris
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HCl缓冲液(10mM Tris，12.5mM MgCl2， pH 8.0)中放置60分钟，以产生DNA1/DNA2双链。
[0015]本专利技术还提供一种名为PfTSDR
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CRISPR检测SARS
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CoV
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2的方法，所述方法包括：将 上述的一种免PAM序列的DNA分子机器与CRISPR
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Cas12a系统耦合，检测SARS
‑
CoV
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2的 RdRp基因。
[0016]进一步的，所述DNA分子机器与CRISPR
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Cas12a系统耦合后，还和等温信号放大相结 合。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免PAM序列的DNA分子机器，其特征在于，所述DNA分子机器的制备方法包括将DNA1/DNA2/DNA3探针、SARS
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CoV
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2的RdRp基因与燃料探针经级联toehold介导的链置换反应(TSDR)获得；所述DNA1/DNA2/DNA3探针为DNA1、DNA2和DNA3形成的探针，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述燃料探针的序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的DNA分子机器，其特征在于，所述DNA1/DNA2/DNA3探针的制备方法包括：将DNA1、DNA2和DNA 3的混合物在95℃下退火5分钟，并缓慢冷却获得。3.根据权利要求1所述的DNA分子机器，其特征在于，所述级联TSDR使用的缓冲液为Tris
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HCl、PBS或HEPES缓冲液。4.根据权利要求1所述的DNA分子机器，其特征在于，所述级联TSDR使用了不同浓度的所述SARS
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CoV
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2的RdRp基因，所述SARS
‑
CoV
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2的RdRp基因的浓度范围为100aM
‑
10pM。5.根据权利要求1所述的DNA分子机器，其特征在于，所述DNA1、DNA2和DNA3探针的摩尔比为1：1
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1.5：1
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2。6.一种检测SARS
‑
CoV
‑
2的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1
‑
5任一项所述的一种免PAM序列的DNA分子机器与CRISPR
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Cas12a系统耦合，检测S...

【专利技术属性】
技术研发人员：史铠，易志刚，宋九华，
申请(专利权)人：乐山师范学院，
类型：发明
国别省市：