靶抗原的多重免疫荧光检测制造技术

描述了一种生物样本的多光谱免疫荧光成像方法。所述方法允许使用直接标记的抗体荧光团缀合物同时直接检测七种或更多种靶抗原。所述方法使得能够在整个平面生物样本上同时多重检测和分析多种生物标志物，从而在免疫治疗和免疫诊断中提供独特的时空洞察力。和免疫诊断中提供独特的时空洞察力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶抗原的多重免疫荧光检测


[0001]本专利技术一般涉及生物样本中多种靶抗原的同时可视化，包括与其相关的方法和试剂。

技术介绍

[0002]多光谱/高维成像对于生物医学研究和临床医学/病理学的从业者来说越来越重要。在组织样本中使多个特定分子可视化的能力为研究和临床医学应用提供了有力的工具。例如，这种能力允许确定不同细胞类型的空间排列，具有用于健康和疾病管理及治疗的应用。
[0003]在医学中，需要检测在组织样本中用作生物分子标志物或“生物标志物”的靶分子，特别是蛋白质，以帮助鉴定患者可能响应的疗法类型。在一个实例中，根据在特定组织中检测到的生物标志物，可以将该组织中出现癌症的患者分组，用于不同的疗法。在病理学中，还可能需要在推荐特定疗法之前对表达特定靶蛋白的细胞的数量进行定量。
[0004]目前使用的免疫组织化学技术通常将检测组织样本的任何一个组织切片中的单个靶蛋白。对于许多疾病(例如乳腺癌)，这意味着在推荐可以进行的最佳疗法之前，必须用不同的抗体标记几个组织切片。
[0005]目前采用的免疫荧光显微术(IFM)技术可以在样本的单个组织切片中同时检测多于一种分子。然而，目前的技术通常使用未缀合的一抗进行间接标记，随后使用缀合至不同荧光团(FP)的不同的二抗来标记一抗，每种荧光团具有不同的发射光谱。这种二次标记过程允许在同一组织切片中单独检测和定位由各种抗体标记的靶蛋白。
[0006]遗憾的是，虽然IFM曾用于生物医学研究和一些临床病理学环境中，但IFM通常仅限于检测两至三种，最多四种不同的颜色；即，检测两至三种不同的抗体标签和核染剂。这种限制是由于传统的荧光显微镜仅具有分离不同荧光团的某些发射光谱的能力。
[0007]目前，多光谱成像的使用已经提高了可以在单个组织切片中区分的荧光团的数量。例如，Opal染色平台可以在单个切片中标记多达9种不同的靶抗原。然而，在组织切片的多光谱、多重成像中存在与使用目前的IFM标记方案相关的重大缺点，包括完成方案所需的劳动强度和时长。
[0008]目前的多重标记技术是劳动密集型的。例如，Opal染色技术通常需要3
‑
5天来完成多色染色。这些平台也很难迭代，这意味着开发新的多色染色方案经常将需要数月。就Opal而言，开发新的和/或改进的面板(panel)需要对IFM和感兴趣的特定标志物有相当多的了解。
[0009]因此，在研究和临床医学中都需要对来自单个组织样本的多种靶分子进行多重免疫荧光检测的新的和改进的方法。
[0010]本专利技术的目的是通过提供一种对来自单个组织样本的多种靶分子进行多重免疫荧光检测的方法，包括其中所用的试剂，至少以某种方式解决现有技术中的上述缺陷，和/或至少为公众提供一种有用的选择。
[0011]在本说明书中，引用了专利说明书、其他外部文献或其他信息来源，这通常是为了提供用于讨论本专利技术特征的上下文。除非另有明确说明，否则对此类外部文献的引用不应解释为承认此类文献或此类信息来源在任何管辖范围内是现有技术，或构成本领域公知常识的一部分。

技术实现思路

[0012]在一方面，本专利技术涉及一种组合物，其包含至少三种、四种、五种、六种或至少七种抗体
‑
荧光团缀合物(Ab
‑
FP)，其中每种FP具有不同的最大荧光激发和发射波长(Ex)。
[0013]在另一方面，本专利技术涉及一种生物样本的直接免疫荧光分析方法，其包括
[0014]a)用至少一种独特的Ab
‑
FP缀合物在生物样本的平面样本中标记至少一种靶抗原，以及
[0015]b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少两种颜色，其中至少一种颜色与至少一种独特的Ab
‑
FP缀合物和至少一种靶抗原的特异性结合相关联，以及
[0016]c)从图像中确定包括至少一种靶抗原的生物标志物的存在或不存在。
[0017]在另一方面，本专利技术涉及一种平面生物样本的多光谱免疫荧光图像，该图像包括至少三种、优选四种、五种、六种、七种、优选至少八种颜色，其中至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种颜色与至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种Ab
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FP和平面样本中包括的靶抗原的特异性结合相关联。
[0018]在另一方面，本专利技术涉及一种检测生物样本中的多种靶抗原的方法，其包括
[0019]a)用至少两种独特的Ab
‑
FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中至少两种靶抗原存在于样本中的细胞上或细胞中，以及
[0020]b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab
‑
FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，以及
[0021]c)从图像中确定至少两种靶抗原的存在或不存在，每种靶抗原用不同的独特的Ab
‑
FP标记。
[0022]在另一方面，本专利技术涉及一种检测生物样本中的多种生物标志物的方法，其包括
[0023]a)用至少两种独特的Ab
‑
FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中样本中的生物标志物包括每种靶抗原，以及
[0024]b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab
‑
FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，以及
[0025]c)从图像中确定多种生物标志物的存在或不存在，每种生物标志物包括用不同的独特的Ab
‑
FP标记的靶抗原。
[0026]在另一方面，本专利技术涉及一种检测生物样本中的多种不同细胞类型的方法，其包括
[0027]a)用至少两种独特的Ab
‑
FP缀合物同时标记平面样本中的至少两种靶抗原，其中靶抗原存在于样本中的细胞上或细胞中，以及
[0028]b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab
‑
FP缀合物和不同细胞类型上的靶抗原的特异性结合相关联，以及
[0029]c)从图像中确定至少两种细胞类型的存在或不存在，每种细胞类型用不同的独特的Ab
‑
FP标记。
[0030]在另一方面，本专利技术涉及一种鉴定生物样本中的多种细胞类型的丰度的方法，其包括：
[0031]a)用至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选至少七种独特的抗体
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荧光团缀合物(Ab
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FP)同时标记平面生物样本，其中每种Ab
‑
FP特异性结合不同细胞上或不同细胞中的靶抗原，以及
[0032]b)通过同时分别检测来自每种Ab
‑
FP的每种FP的荧光发射光谱来生成经标记的平面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包含至少三种、四种、五种、六种或至少七种抗体
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荧光团缀合物(Ab
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FP)，其中每种FP具有不同的荧光激发和发射光谱(Ex)。2.根据权利要求1所述的组合物，其包含七种Ab
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FP。3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中每种Ab
‑
FP是独特的Ab
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FP。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少八种、九种、十种、十一种或十二种Ab
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FP。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中每种FP的最大激发和发射波长(Ex/Em)选自由348/395、404/448、405/421、405/510、405/570、405/603、405/646、405/711、407/421、415/500、436/478nm、490/515nm、494/520nm、495/519nm、485/693nm、496/578、532/554nm、566/610nm、590/620nm、650/660nm、650/668nm、652/704、696/719nm、753/785nm、754/787nm、755/775nm和759/775nm组成的组。6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述FP中的至少一种、两种或三种的所述最大荧光发射波长(Em)为约710nm至约850nm。7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述FP中的至少一种、两种或三种的所述Em为约753nm至约759nm，优选753nm、754nm、755nm或759nm。8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述FP选自由Ex/Em为348/395的Brilliant
TM
Ultraviolet 395(BUV395)、Ex/Em为436/478nm的Brilliant
TM
Violet 480(BV480)、Ex/Em为405/421的Brilliant Violet 421
TM
、Ex/Em为407/421的Brilliant
TM
Violet 421(BV421)、Ex/Em为405/510的Brilliant
TM
Violet 510(BV510)、Ex/Em为405/570的Brilliant Violet 570
TM
、Ex/Em为405/603的Brilliant Violet 605
TM
、Ex/Em为405/646的Brilliant Violet 650
TM
、Ex/Em为405/711的Brilliant Violet 711
TM
、Ex/Em为404/448的BD Horizon
TM
V450、Ex/Em为415/500的BD Horizon
TM
V500、Ex/Em为490/515nm的Brilliant
TM
Blue 515(BB515)、Ex/Em为494/520nm的异硫氰酸荧光素(FITC)、Ex/Em为495/519nm的Alexa Fluor 488(AF488)、Ex/Em为532/554nm的Alexa Fluor 532(AF532)、Ex/Em为496/578的R
‑
藻红蛋白(PE)、Ex/Em为590/620nm的Alexa Fluor 594(AF594)、Ex/Em为566/610nm的PE
‑
Dazzle 594(PE594)或PE
‑
CF594(CF594)、Ex/Em为650/668nm的Alexa Fluor 647(AF647)、Ex/Em为650/660nm的别藻蓝蛋白(APC)、Ex/Em为485/693nm的BD Horizon
TM
700(BB700)、Ex/Em为696/719nm的Alexa Fluor 700(AF700)、Ex/Em为753/785nm的APC/Alexa Fluor 750、Ex/Em为754/787nm的APC/Fire 750、Ex/Em为652/704的APC
‑
R700、Ex/Em为755/775nm的APC
‑
Cy7以及Ex/Em为759/775nm的AF750组成的组。9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述荧光团选自由BV480、BB515、AF532、PE
‑
CF594、AF647、AF700以及BB700组成的组。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab
‑
FP中的所述Ab选自由抗CD31、CD141、CD144、CD3、CD34、CD163、CD11c、CD14、CD16、CD68、Foxp3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD38、PD
‑
1、PDL1、PDL2、CD68、Ki
‑
67、Sox10、S100、PRAME、MART1以及抗CD21抗体组成的组。11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述Ab
‑
FP中的所述Ab选自由抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki
‑
67、CD11c以及抗CD21抗体组成的组。12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其包含所述以下抗体中的至少三种，
优选四种、五种、六种或优选所有七种：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki
‑
67、CD11c和抗CD21抗体。13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其包含所述以下Ab
‑
FP中的至少三种，优选四种、五种、六种或优选所有七种：CD31
‑
BV480；CD141
‑
BB515；CD3
‑
AF532；CD34
‑
PE
‑
CF594；Ki67
‑
AF647、CD11c
‑
AF700和CD21
‑
BB700。14.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab
‑
FP中的所述Ab包括选自由抗雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、her2以及抗细胞角蛋白抗体组成的组的一种或多种Ab。15.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab
‑
FP中的所述Ab包括一种或多种抗错配修复蛋白抗体或抗突变型错配修复蛋白抗体。16.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab
‑
FP中的所述Ab包括选自由抗b
‑
raf(V600E突变)、MLH1、MSH2、MSH6以及抗PMS2抗体组成的组的一种或多种抗体。17.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中每种Ab特异性结合靶抗原。18.根据权利要求17所述的组合物，其中每种靶抗原是蛋白质或细胞类型、优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得，
申请(专利权)人：奥克兰联合服务有限公司，
类型：发明
国别省市：