一种烟叶落黄调控基因NtMYB2、蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟叶落黄调控基因NtMYB2、蛋白及其应用。烟草NtMYB2基因受烟草叶龄调控，在落黄的烟叶中表达量较高。与K326相比，烟草NtMYB2基因过表达烟草植株表现出烟叶落黄时间较早的早衰表型。烟草NtMYB2基因在烟草落黄调控过程中发挥重要作用，可应用于烟叶落黄的基因功能研究和基因工程育种。叶落黄的基因功能研究和基因工程育种。

【技术实现步骤摘要】
一种烟叶落黄调控基因NtMYB2、蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于烟草基因工程
，具体涉及一种与烟叶落黄相关的烟草NtMYB2基因、蛋白及其在调控烟叶落黄中的应用。

技术介绍

[0002]烟草是重要经济作物，叶片是其收获器官，随着烟草进入生育后期，叶片进入落黄阶段，烟草上部、中部、下部叶片成熟时期不相同，通常，生产上采用不同部位不同时期采收的策略完成，拖延了采收时间，另一方面，环境因素如接近采收时期连续雨天可能会造成烟叶“二次返青”影响采收。因此，利用基因工程技术，可以调控烟叶落黄时间，有效解决不同部位烟草叶片成熟度不一致及返青问题。
[0003]目前，在植物中，MYB转录因子家族是植物转录因子家族中较大的一类家族，其含有高度保守的DNA结合域，是由50
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52个氨基酸为一个重复单元的肽段。MYB转录因子家族成员在植物生物与非生物胁迫、次生代谢和生长发育中起重要作用。目前，没有MYB转录因子在烟叶落黄上的研究和应用。
[0004]在烟叶生产中，烟草叶片落黄通过改变光合作用的持续时间或者通过改变营养物质的转移效率来影响产量。烟叶落黄过程中营养物质的消耗、转运和转化会对烟叶的产量和品质起决定性作用。
[0005]利用基因工程技术，从烟草中鉴定出烟叶落黄相关调控基因并将其应用到烟草分子育种中，对于保证烟叶的品质和产量具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的在于提供一个调控烟叶落黄的烟草NtMYB2基因，利用烟叶落黄相关的NtMYB2基因所构建的重组过表达载体转化烟草，提高NtMYB2基因表达量进而能够调控烟叶落黄时间，从而为品种选育提供育种中间材料。
[0007]一种烟叶落黄调控基因NtMYB2，基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]进一步的，所述的基因序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的基因序列；所述的类似功能包括调控烟叶落黄。
[0009]进一步的，所述的调控烟叶落黄包括调控烟叶落黄时间。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供一种烟叶落黄调控蛋白，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]进一步的，所述的蛋白序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的蛋白序列；所述的类似功能包括调控烟叶落黄。
[0012]进一步的，所述的调控烟叶落黄包括调控烟叶落黄时间。
[0013]本专利技术的第三个目的是提供所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2用于调控烟叶落黄的应用。
[0014]进一步的，所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2用于调控烟叶落黄的时间。
[0015]进一步的，通过过表达烟叶落黄调控基因NtMYB2，获得烟叶落黄时间提前的烟草转化植株。
[0016]进一步的，过表达烟叶落黄调控基因NtMYB2的载体为双元农杆菌载体pCHF3。
[0017]构建重组表达载体时，将NtMYB2基因CDS碱基序列插入花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子之后。
[0018]所述转化烟草为使用含有重组过表达载体的农杆菌侵染烟草愈伤组织，利用农杆菌介导的转化方法，将花椰菜花叶病毒35S启动子和烟草NtMYB2基因整合进烟草基因组。在烟草内，通过对NtMYB2基因过表达，使烟叶落黄时间提前。
[0019]本专利技术首次在烟草中完成了NtMYB2基因的克隆、表达和功能分析，分析结果表明该基因与烟草的烟叶落黄相关。在烟草中，过表达NtMYB2基因使烟叶落黄时间明显提前，从而为品种选育提供育种中间材料。
附图说明
[0020]图1烟草NtMYB2基因克隆PCR扩增产物电泳图；
[0021]图1中M为2000bp DNA maker；1为NtMYB2基因扩增结果；2为阴性对照；
[0022]图2烟草NtMYB2基因在烟叶发育过程中的表达模式分析；
[0023]图2中S1为幼嫩烟草叶片；S2为成熟叶片；S3为开始落黄的叶片；S4为充分落黄的叶片；
[0024]图3烟草NtMYB2基因过表达植株中NtMYB2的表达量分析；
[0025]图4烟草NtMYB2基因过表达植株和K326对照的烟叶落黄情况分析；
[0026]图5烟草NtMYB2基因过表达植株和K326对照的烟叶生理指标分析。
具体实施方式
[0027]下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，而不会形成对本专利技术的限制，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。
[0028]生物材料：
[0029]烟草材料，栽培烟草(Nicotiana tabacum)品种K326保存于本实验室。过量表达烟草基因所用到的载体质粒pCHF3保存于本实验室，载体构建方法参考文献(https://www.mdpi.com/2073
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4409/8/1/50)。
[0030]实验试剂：
[0031]本实验开展过程中所使用的试剂及试剂盒如下：限制性内切酶购于NEB(北京)有限公司；RNA提取TRIzol试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司；高保真DNA扩增酶、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA凝胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、质粒DNA小量纯化试剂盒MiniBEST Plasmid purification Kit购买于Invitrogen公司；卡那霉素、利福平等抗生素购于上海生工生物工程有限公司。
[0032]实施例1
[0033]本实施例主要就NtMYB2基因的鉴定和克隆过程简要介绍说明如下。
[0034]1、总RNA提取
[0035]采用康为世纪公司的TRIzol试剂提取法提取RNA，具体步骤如下：在正常生长条件下，生长4周的栽培烟草K326取材后迅速在液氮中研磨成粉末状，每30
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50mg组织加入1ml TRIzon Reagent(cwbiotech)，混匀；室温放置5min后，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2min。4℃12,000rpm离心10分钟，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入等体积的70％乙醇。将混合液全部转移到吸附柱中，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液。加入500μl Buffer RW2，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液。空离2min，倒掉收集管中的废液，室温放置5min，加入30μl水，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，
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70℃保存RNA，防止降解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理。
[0036]2、反转录反应
[0037]反转录步骤采取诺唯赞公司R323试剂盒，具体步骤如下：取1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟叶落黄调控基因NtMYB2，其特征在于，基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2，其特征在于，所述的基因序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的基因序列；所述的类似功能包括调控烟叶落黄。3.根据权利要求2所述的烟叶落黄调控基因NtMYB2，其特征在于，所述的调控烟叶落黄包括调控烟叶落黄时间。4.一种烟叶落黄调控蛋白，其特征在于，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求4所述的烟叶落黄调控蛋白，其特征在于，所述的蛋白序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓旭，王东，蒲文宣，周文辉，高军平，刘万峰，张新要，宋卫武，陈凯，
申请(专利权)人：湖南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：