一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用，通过前期建立的布鲁氏菌纳米抗体展示文库，利用OMP16重组蛋白进行筛选，获得布鲁氏菌OMP16纳米抗体核酸序列，该纳米抗体能够特异性识别布鲁氏菌外膜蛋白OMP16，能够有效阻断布鲁氏菌阳性血清与Omp16的结合，因此，利用此抗体，可以建立阻断ELISA、胶体金等检测方法对布鲁氏菌病进行检测。检测方法对布鲁氏菌病进行检测。检测方法对布鲁氏菌病进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫检测
，具体涉及一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，WHO将布鲁氏菌病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。布病主要是通过直接或间接接触染病动物或动物产品而感染。人类患布病后，会引起发热、肌肉和关节疼痛等，严重者完全丧失劳动能力；家畜感染布病则引起流产和不育，给养殖业造成巨大的经济损失，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全。
[0003]准确诊断是布病防控极为重要的环节。布病诊断又分为血清学诊断和病原学诊断，相对于常用的布病血清学诊断方法，布病病原学诊断对实验室生物安全级别和实验人员要求都比较高。目前布病病原学诊断方法主要包括细菌分离、生化鉴定分型、核酸检测等，其中核酸检测又有AMOS
‑
PCR、Bruce
‑
ladder PCR、real
‑
time PCR、MLVA等方法。而上述病原学诊断方法的开展都需要在专业布病实验室完成，操作人员必须经过专门培训，一次检测至少需要2小时以上。因此开发针对布病的病原学现场快速诊断方法十分必要。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供了一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用，此纳米抗体能够特异性识别布鲁氏菌外膜蛋白OMP16，能够有效阻断布鲁氏菌阳性血清与Omp16的结合，因此，利用此抗体，可以建立阻断ELISA、胶体金等检测方法对布鲁氏菌病进行检测。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0006]一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体，该特异性纳米抗体通过以下步骤制备：
[0007](1)Omp16的诱导表达
[0008]将实验室保存的pGEX4T
‑1‑
Omp16质粒转化至BL21(DE3)中，挑取单克隆活化至对数生长期(OD600nm至0.6～0.8之间)，冷却至室温，加入终浓度为1mM的IPTG，转入22℃，200r/min培养16h，诱导表达蛋白；6000r/min常温离心10min，弃掉上清，菌体使用1/20体积的PBS重悬，以超声3s，间歇3s超声破碎菌体，12000r/min，4℃离心10min，分离上清和沉淀；
[0009](2)Omp16蛋白的纯化
[0010]取超声后上清，使用0.45μM滤器过滤除杂质，放置于冰上备用；将取1mL GST resin至层析柱中，带介质自然沉降，加入10倍体积PBS平衡柱子；加入过滤后的表达上清，调整流速为0.5mL/min，吸附目的蛋白；上样结束后，加入10
‑
20倍体积的PBS洗脱杂蛋白，至
流出液再280nm吸光度接近0，使用洗脱缓冲液(50mM Tris
‑
Cl，10mM还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白，控制流速为0.5mL/min，收集流出液，SDS
‑
PAGE检测流出液的蛋白含量，并将蛋白透析至PBS溶液中，测定蛋白浓度，分装冻存至
‑
80℃冰箱；
[0011](3)Omp16特异性噬菌体的淘选
[0012]将纯化的Omp16蛋白用PBS缓冲液稀释至200μg/mL，包被至96孔酶标板上，每孔100μL，共包被3个孔，同时设置PBS对照孔，4℃包被过夜；弃去包被液，PBS
’
T洗板三次后，加入200μL 2.5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；弃去封闭液，加入2.5％脱脂奶粉稀释的噬菌体5
×
10
10
PFU/孔，37℃孵育2h；弃去噬菌体上清，使用PBS
’
T洗板10次，PBS洗板5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1M三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1MTris
‑
HCl(pH＝7.4)中和洗脱物；取400μL淘选产物按照文库救援的方法救援淘选噬菌体，同时检测噬菌体滴度；将救援后的噬菌体按照同样的方法进行第二轮、第三轮淘选，第二轮、第三轮淘选Omp16的包被浓度分别为100、50μg/mL；
[0013](4)纳米抗体粗提物的制备
[0014]随机挑取96个最后一轮淘选噬菌体单克隆至100μL LB/AMP
‑
GLU培养基中，37℃200r/min培养8h；每个克隆取10μL培养物转接至500μL TB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入10μL 100mM IPTG，继续培养12
‑
14h；12000r/min离心2min，收集菌体，
‑
80℃、37℃反复冻融三次裂解菌体，加入500μL PBS 4℃孵育30min重悬菌体，离心后上清即为粗提物。
[0015]进一步地，步骤(3)中，文库救援的方法包括如下步骤：
[0016]取100μL噬菌体展示文库，接种于100mL 2
×
YT/AMP
‑
GLU培养基(含有1μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)中，37℃，200r/min培养至对数生长期；加入20个MOI剂量的辅助噬菌体M13K07，37℃静置30min，2800g室温离心10min，弃上清，沉淀使用200mL 2
×
YT/AMP
‑
KAN(含有1μg/mL氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬，37℃，200r/min培养14
‑
16h；3800g，4℃离心30min，收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl(200g PEG6000，146g NaCl加水溶解，定容至1L)，混匀，冰上静置6
‑
8h；3800g，4℃离心30min弃上清，加入1mL PBS溶液重悬沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解，12000g 4℃离心15min，收集上清，并使用对数生长期的TG1测定救援噬菌体滴度。
[0017]本专利技术还公开了上述的一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体的表达载体，通过以下方法构建：
[0018]将NbA4的基因序列通过Pst I和Not I两个酶切位点插入至pCMV
‑
HRP表达载体中，构建重组质粒，PCR和测序验证重组质粒的正确性，提取无内毒素的pCMV
‑
NbA4
‑
HRP重组质粒，使用Lipo8000(碧云天)，12孔板每孔配制如下反应体系：Lipo80001.6μL，pCMV
‑
NbA4
‑
HRP 1μg，Opti
‑
mem 50μL，将质粒转染至融合度为60
‑
70％的HEK
‑
293T细胞中，48h后收取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体，其特征在于：该特异性纳米抗体通过以下步骤制备：(1)Omp16的诱导表达将实验室保存的pGEX4T
‑1‑
Omp16质粒转化至BL21(DE3)中，挑取单克隆活化至对数生长期，冷却至室温，加入终浓度为1mM的IPTG，转入22℃，200r/min培养16h，诱导表达蛋白；6000r/min常温离心10min，弃掉上清，菌体使用1/20体积的PBS重悬，以超声3s，间歇3s超声破碎菌体，12000r/min，4℃离心10min，分离上清和沉淀；(2)Omp16蛋白的纯化取超声后上清，使用0.45μM滤器过滤除杂质，放置于冰上备用；将取1mL GST resin至层析柱中，带介质自然沉降，加入10倍体积PBS平衡柱子；加入过滤后的表达上清，调整流速为0.5mL/min，吸附目的蛋白；上样结束后，加入10
‑
20倍体积的PBS洗脱杂蛋白，至流出液再280nm吸光度接近0，使用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，控制流速为0.5mL/min，收集流出液，SDS
‑
PAGE检测流出液的蛋白含量，并将蛋白透析至PBS溶液中，测定蛋白浓度，分装冻存至
‑
80℃冰箱；(3)Omp16特异性噬菌体的淘选将纯化的Omp16蛋白用PBS缓冲液稀释至200μg/mL，包被至96孔酶标板上，每孔100μL，共包被3个孔，同时设置PBS对照孔，4℃包被过夜；弃去包被液，PBS
’
T洗板三次后，加入200μL 2.5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；弃去封闭液，加入2.5％脱脂奶粉稀释的噬菌体5
×
10
10
PFU/孔，37℃孵育2h；弃去噬菌体上清，使用PBS
’
T洗板10次，PBS洗板5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1M三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1M pH＝7.4的Tris
‑
HCI中和洗脱物；取400μL淘选产物按照文库救援的方法救援淘选噬菌体，同时检测噬菌体滴度；将救援后的噬菌体按照同样的方法进行第二轮、第三轮淘选，第二轮、第三轮的淘选Omp16的包被浓度分别为100、50μg/mL；(4)纳米抗体粗提物的制备随机挑取96个最后一轮淘选噬菌体单克隆至100μL LB/AMP
‑
GLU培养基中，37℃200r/min培养8h；每个克隆取10μL培养物转接至500μL TB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入10μL 100mM IPTG，继续培养12
‑
14h；12000r/min离心2min，收集菌体，
‑
80℃、37℃反复冻融三次裂解菌体，加入500μL PBS 4℃孵育30min重悬菌体，离心后上清即为粗提物。2.如权利要求1所述的一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体，其特征在于：步骤(3)中，文库救援的方法包括如下步骤：取100μL噬菌体展示文库，接种于100mL 2
×
YT/AMP
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GLU培...

【专利技术属性】
技术研发人员：张璐，王爱华，靳亚平，周栋，余思源，翟云逸，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：