一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法技术

本发明专利技术公开了一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，属于呼吸道抽吸物样本处理技术领域，解决了现有呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道抽吸物样本处理时间长达24

【技术实现步骤摘要】
一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法


[0001]本专利技术涉及病原体鉴定
，尤其涉及一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法。

技术介绍

[0002]呼吸机相关性肺炎指患者接受机械通气48h以后或在拔管48h以内出现的肺炎，是接受机械通气的患者最常见的并发症和死亡原因之一。研究表明，对怀疑患有呼吸机相关性肺炎的患者尽早给予合适的抗菌药物可明显缩短患者患病时间，减少疾病恶化和患者死亡的概率。
[0003]现有的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理通常需要24
‑
48h，若想要获得抽吸物中病原体的药敏结果，则需48
‑
72h，处理时间长，处理效率低。

技术实现思路

[0004]鉴于上述的分析，本专利技术旨在提供一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，用以解决现有呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道抽吸物样本处理时间长达24
‑
48h，处理效率低的技术问题。
[0005]本专利技术的目的主要是通过以下技术方案实现的：
[0006]本专利技术提供了一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，包括以下步骤：
[0007]S1、样本处理；
[0008]包括S11.使用皂苷对样本宿主基因进行去除；S12.批量提取DNA；
[0009]S2、构建多样本PCR扩增DNA测序文库；
[0010]S3、对DNA测序文库中的DNA测序；
[0011]使用MinION纳米孔测序仪进行DNA测序，实时进行数据收集；
[0012]S4、对收集的数据进行筛选和分析；
[0013]S5、对处理的样本进行病原体基因拼接；
[0014]S6、对拼接成功的细菌进行耐药性检测。
[0015]进一步地，在S11中，使用皂苷对样本宿主基因进行去除的过程包括以下子步骤：
[0016]S111、用250μl无菌PBS缓冲液将临床下呼吸道样本沉淀重悬，充分吹打混匀；
[0017]S112、加入200μl 5％无菌皂苷溶液使用无菌无酶去离子水溶解，涡旋15s混匀，室温静置10min，以使皂苷溶液和样本充分混合，皂苷可使宿主细胞膨胀破裂；
[0018]S113、加入350μl无菌无酶去离子水，室温静置30s；
[0019]S114、加入12μl 5M NaCl溶液，上下颠倒混匀，以终止皂苷的膨胀作用；
[0020]S115、8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；
[0021]S116、沉淀使用100μl无菌PBS缓冲液重悬，加入100μl HL
‑
SAN缓冲液，涡旋15s混匀，加入10μl HL
‑
SAN酶，颠倒混匀，消化游离核酸；
[0022]S117、37℃水浴，高速震荡15min；
[0023]S118、8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；
[0024]S119、加入800μl无菌PBS缓冲液，颠倒混匀，8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；
[0025]S1110、加入1000μl无菌PBS缓冲液，颠倒混匀，8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液。
[0026]进一步地，在S116步骤中，HL
‑
SAN缓冲液的配置过程为：将0.2gMgCl2‑
6H2O溶于5M NaCl中，定容至10ml后使用0.22μm过滤器过滤得到。
[0027]进一步地，在S12中，使用BSCC45S1E试剂盒和自动DNA提取仪进行DNA提取。
[0028]进一步地，在S12中，DNA提取过程包括以下子步骤：
[0029]S121、BSCC45S1E试剂盒所带溶菌酶全部溶于TET缓冲液中，震荡混匀；
[0030]S122、180μl混合液重悬沉淀，震荡混匀后37℃孵育30min；
[0031]S123、向试剂盒第1、7列加入20μl蛋白酶K和含菌重悬液；
[0032]S124、试剂盒放入机器中，设定程序：S125、待提取完成后使用Nanodrop进行DNA浓度和纯度鉴定，使用Qubit进行浓度精准定量。
[0033]进一步地，在S2中，使用快速条码试剂盒SQK
‑
RBK004进行多样本快速DNA测序文库构建，所有操作均于超净台中进行，所有仪器紫外照射至少30min；所有试剂置于冰上融化，使用前离心处理，吹打混匀。
[0034]进一步地，在S3中，DNA测序过程中，使用芯片引发试剂盒EXP
‑
FLP002进行芯片引发，所有操作于超净台中进行，所用除芯片外的其他仪器紫外照射30min；使用FLO
‑
MIN106D R9.4芯片和MinION测序仪进行测序。
[0035]进一步地，在S3中，DNA测序过程具体包括以下子步骤：
[0036]S31、将FLO
‑
MIN106D R9.4芯片插入MinION测序仪中，连接笔记本电脑，使用MinKNOW软件Flowcell Test模块进行芯片检测，新芯片纳米孔道数大于800为合格芯片；
[0037]S32、断开测序仪与电脑的连接，测序仪拿入超净台中上样；
[0038]S33、向一支试剂FLB中加入30μl试剂FLT，吹打混匀；
[0039]S34、打开引发孔，吸出孔中空气；
[0040]S35、加入800μl FLB+FLT混合试剂，关闭引发孔，室温静置5min；
[0041]S36、打开引发孔和上样孔，向引发孔中加入200μl FLB+FLT混合试剂，向上样孔中悬空滴加75μl文库；
[0042]S37、测序仪连接笔记本电脑，使用MinKNOW软件进行测序。
[0043]进一步地，在S37中，根据使用试剂盒进行程序设定，实时进行数据分析，待出现临床致病菌序列后继续测序1
‑
2h，若无其他致病菌序列出现，则停止测序，断开电脑与测序仪的连接。
[0044]进一步地，S4步骤中的对收集的数据进行筛选和分析包括：对收集的数据进行筛选和分析的过程包括：先进行碱基判读，碱基判读后进行数据过滤，数据过滤后进行数据质控，并进行宿主基因对比去除，然后进行分类分析。
[0045]与现有技术相比，本专利技术至少可实现如下有益效果之一：
[0046](1)本专利技术可针对呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道样本进行快速病原体鉴定，将病原体鉴定用时从常规24～48h缩短到6h以内。
[0047](2)本专利技术可有效去除宿主基因组信息，增加纳米孔宏基因组学测序病原体序列获得量。
[0048](3)现有细菌耐药性检测需要48
‑
72小时出结果，采用本专利技术的处理方法只需要6小时就可以获得初步的耐药基因信息，提供耐药和潜在耐药可能的选择。
[0049]本专利技术中，上述各技术方案之间还本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样本处理；包括S11.使用皂苷对样本宿主基因进行去除；S12.批量提取DNA；S2、构建多样本PCR扩增DNA测序文库；S3、对DNA测序文库中的DNA测序；使用MinION纳米孔测序仪进行DNA测序，实时进行数据收集；S4、对收集的数据进行筛选和分析；S5、对处理的样本进行病原体基因拼接；S6、对拼接成功的细菌进行耐药性检测。2.根据权利要求1所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述S11中，所述使用皂苷对样本宿主基因进行去除的过程包括以下子步骤：S111、用250μl无菌PBS缓冲液将临床下呼吸道样本沉淀重悬，充分吹打混匀；S112、加入200μl 5％无菌皂苷溶液使用无菌无酶去离子水溶解，涡旋15s混匀，室温静置10min，以使皂苷溶液和样本充分混合，皂苷可使宿主细胞膨胀破裂；S113、加入350μl无菌无酶去离子水，室温静置30s；S114、加入12μl 5M NaCl溶液，上下颠倒混匀，以终止皂苷的膨胀作用；S115、8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；S116、沉淀使用100μl无菌PBS缓冲液重悬，加入100μl HL
‑
SAN缓冲液，涡旋15s混匀，加入10μl HL
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SAN酶，颠倒混匀，消化游离核酸；S117、37℃水浴，高速震荡15min；S118、8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；S119、加入800μl无菌PBS缓冲液，颠倒混匀，8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液；S1110、加入1000μl无菌PBS缓冲液，颠倒混匀，8000rpm 4℃离心5min，弃去上清液。3.根据权利要求2所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述S116步骤中，所述HL
‑
SAN缓冲液的配置过程为：将0.2g MgCl2‑
6H2O溶于5M NaCl中，定容至10ml后使用0.22μm过滤器过滤得到。4.根据权利要求3所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述S12中，使用BSCC45S1E试剂盒和自动DNA提取仪进行DNA提取。5.根据权利要求4所述的呼吸机相关性肺炎下呼吸道抽吸物的样本处理方法，其特征在于，在所述S12中，DNA提取过程包括以下子步骤：S121、BSCC45S1E试剂盒所带溶菌酶全部溶于TET缓冲液中，震荡混匀；S122、180μl混合液重悬沉淀，震荡混匀后3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴楠，沈宁，贺蓓，杨萍，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：