猪神经元及其分离培养方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种猪神经元及其分离培养方法和应用。该猪神经元的分离培养方法包括以下步骤：将猪大脑消化，制备分散的神经元；及将神经元接种于改良培养基中培养，其中，改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1％～3％的添加剂、1mM～3mM的L

【技术实现步骤摘要】
猪神经元及其分离培养方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，特别是涉及一种猪神经元及其分离培养方法和应用。

技术介绍

[0002]神经退行性疾病是一类因神经元结构或功能逐渐丧失甚至死亡而引起神经系统功能障碍的疾病，由于神经元或其髓鞘的丧失，神经退行性疾病随着时间的推移而恶化，最终导致神经功能障碍。常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆等。除了少数家族性神经退行性疾病有明确的致病基因外，大多数神经退行性疾病的发病机制尚不清楚，也缺乏有效的治疗手段。神经退行性疾病共有的病理特征是神经元的损伤和丢失及细胞内蛋白聚集。因此，建立这类疾病的神经细胞模型将为探索该类疾病的致病机理、治疗策略等奠定牢固的基础。
[0003]在神经退行性疾病的发生发展中扮演重要角色的微管相关蛋白tau(microtubule
‑
associated protein tau，简称tau蛋白)，是成熟神经元的主要微管相关蛋白。Tau蛋白是一种含有磷酸基的蛋白，但是当该蛋白出现过度磷酸化时，就会丧失其生物活性，进而产生各种神经病理现象。与tau蛋白异常相关的神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、额颞叶痴呆、皮质基底节综合征、帕金森综合征、伴步态冻结的纯性运动障碍、以及罕见的运动神经元症状或小脑共济失调。
[0004]最常见的神经退行性疾病动物模型是小鼠模型，但啮齿动物和灵长类动物之间存在相当大的差异。例如，纹状体是亨廷顿疾病中受影响最严重的区域，而灵长类动物和大动物(例如猪)的纹状体由尾状核和壳核组成，啮齿动物(例如小鼠)的纹状体的尾状核和壳核是无法区分的；又例如，在脑结构和体积中，小鼠大脑没有沟回且体积与人类大脑相差甚远。而且，有研究表明，在各种神经退行性疾病中，小鼠模型难以很好的模拟与该疾病患者类似的表型和病理特征。例如亨廷顿舞蹈症患者脑内会出现大量神经元的丢失与死亡，但在小鼠模型中看不到明显的神经元的死亡现象。此外，很多在小鼠实验中验证有疗效的药物，在临床实验中发现对病人没有疗效，这说明啮齿动物和人类大脑之间神经病理学的差异，也体现了对更接近人类的大型哺乳动物的研究需求。
[0005]在大动物猪模型中，其大脑与人类大脑结构相似，都有大量的沟回，且其体积也与人脑体积更为接近。其中猪亨廷顿疾病模型不仅可以表现出与病人相似的舞蹈样运动障碍，而且出现了与患者相似的选择性神经元死亡以及纹状体萎缩现象。并且，猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似。此外，猪的体型大小和驯服习性允许进行反复采样和进行各种外科手术。所以更多科学家开始把目光转移到猪身上，尤其是小型猪。
[0006]目前，分离及培养啮齿类动物如小鼠的神经元已经非常成熟，但对于猪神经元，虽然能够成功分离，但还不能满足神经退行性疾病研究的需求。

技术实现思路

[0007]基于此，有必要提供一种猪神经元的分离培养方法，以弥补没有可用于神经退行性疾病研究的猪神经元的分离培养方法的缺陷。
[0008]一种猪神经元的分离培养方法，包括以下步骤：
[0009]将猪大脑消化，制备分散的神经元；及
[0010]将所述神经元接种于改良培养基中培养，其中，所述改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1％～3％的B
‑
27添加剂、1mM～3mM的L
‑
谷氨酰胺和15μg/mL～25μg/mL的抗生素。
[0011]上述猪神经元的分离培养方法通过采用含有1％～3％的B
‑
27添加剂、1mM～3mM的L
‑
谷氨酰胺和15～25μg/mL的抗生素的神经细胞基础培养基培养来自大脑皮层的神经元，培养时间可达到12天以上，并且培养过程中可见神经突起的生长，能够用于神经退行性疾病研究。
[0012]在其中一个实施例中，所述改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为5％～2％的B
‑
27添加剂、5mM～2.5mM的L
‑
谷氨酰胺和15～20μg/mL的抗生素。
[0013]在其中一个实施例中，所述抗生素包括青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素中一种或多种。
[0014]在其中一个实施例中，所述制备分散的神经元的步骤包括：在将所述猪大脑消化后，将含有细胞的混合液过滤和/或离心以去除未完全消化的组织块的操作。
[0015]上述的猪神经元的分离培养方法培养得到的猪神经元。
[0016]一种用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0017]采用含有表达tau突变蛋白元件的腺相关病毒感染上述的猪神经元的分离培养方法培养得到的猪神经元，并采用所述改良培养基继续培养感染了所述腺相关病毒的猪神经元，制备用于研究神经退行性疾病的细胞。
[0018]在其中一个实施例中，所述tau突变蛋白包括tau
P301L
、tau
P301S
、tau
V377M
、tau
R406W
和tau
G272V
中的至少一种。
[0019]在其中一个实施例中，所述腺相关病毒为AAV9。
[0020]上述的用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法制得的细胞。
[0021]一种筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物的方法，所述方法使用上述的猪神经元的分离培养方法制得的猪神经元或上述的用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法制得的细胞，筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物。
附图说明
[0022]图1为实施例1的分离得到的神经元培养2天、5天、8天和12天的形态；
[0023]图2为实施例1的分离得到的神经元培养8天的β
‑
tubulin3免疫荧光染色结果；
[0024]图3为实施例1中感染AAV
‑
Tau(P301L)病毒后的神经元的免疫荧光染色结果；
[0025]图4为实施例2的分离得到的神经元培养2天、5天、8天和12天的形态；
[0026]图5为实施例3的分离得到的神经元培养2天、5天、8天和12天的形态。
具体实施方式
[0027]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。
[0028]术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。术语“可选地”表示举例说明。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0029]术语“神经元”即神经元细胞，是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪神经元的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将猪大脑消化，制备分散的神经元；及将所述神经元接种于改良培养基中培养，其中，所述改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1％～3％的添加剂、1mM～3mM的L
‑
谷氨酰胺和15μg/mL～25μg/mL的抗生素，所述添加剂为B
‑
27添加剂或无氧化剂的B
‑
27添加剂。2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1.5％～2％的B
‑
27添加剂、1.5mM～2.5mM的L
‑
谷氨酰胺和15μg/mL～20μg/mL的抗生素。3.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述抗生素包括青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素中一种或多种。4.根据权利要求1～3任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述制备分散的神经元的步骤包括：在将所述猪大脑消化后，将含有细胞的混合液过滤和/或离心以去除未完全消化的组织块的操作。5.权利要求1～4任一项所述的猪神经元的分离培养方法培...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫森，李彩娟，李世华，李晓江，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：