一种靶向感染乳腺癌细胞的AAV载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向乳腺癌细胞的嵌合AAV2衣壳、靶向感染乳腺癌细胞的AAV2载体构建方法、使用所述载体靶向乳腺癌细胞的方法以及携带自杀基因治疗乳腺癌的方法。本发明专利技术通过基因工程技术将EC1蛋白插入到AAV2衣壳表面以及突变VP1蛋白R585、R588位点，获得一种AAV病毒载体（AAV2M

【技术实现步骤摘要】
一种靶向感染乳腺癌细胞的AAV载体及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种靶向感染乳腺癌细胞的AAV病毒及其应用。

技术介绍

[0002]乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤之一。研究报道，每年中乳国乳腺癌新发病数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％，并且有逐年增高的趋势。由于乳腺癌病理学分型复杂，导致其治疗针对性差和反应差异大。随着对乳腺癌认识的不断深入，以及当前个性化医疗理念的发展，乳腺癌的治疗进入了综合治疗时代，形成了乳腺癌局部治疗与全身治疗并重的治疗模式。目前，临床上根据肿瘤分期，常综合采用手术切除、放化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段。目前，化疗药物的毒副作用及肿瘤耐药性的产生是临床亟待解决的问题。肿瘤靶向治疗是近年来的抗肿瘤研究热点，与化疗相比分子靶向治疗在靶向性和毒副作用方面具有明显优势，因此开发一种可靶向乳腺癌细胞的药物递送载体对于乳腺癌的治疗具有重要的临床意义。
[0003]腺相关病毒(adeno
‑
associated virus，AAV)作为基因递送的载体，具有安全性好、免疫原性低、表达稳定等优点，在基因治疗中得到广泛应用。近年来，AAV介导的肿瘤基因治疗备受关注，AAV已成功用于传递和转导各种肿瘤治疗基因(自杀基因、抗血管生成基因、免疫相关基因等)以抑制肿瘤发生、发展和转移。如何消除AAV2原有的组织嗜性(脱靶效应)并赋予新的靶向能力是开发靶向乳腺癌载体的关键。由于AAV的衣壳蛋白决定AAV组织细胞特异性，因此对AAV衣壳蛋白的修饰和改造可以提高AAV的靶向性。上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecuLes，EpCAM)是一种I型跨膜糖蛋白，主要参与细胞增殖、分化、迁移和肿瘤细胞免疫逃逸等多种生理活动。有研究报道，在原发性乳腺癌组织中EpCAM的表达比正常组织高100余倍，因此EpCAM可作为乳腺癌的潜在靶向分子，可以将其引入AAV病毒载体中增强AAV病毒的靶向性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种可靶向感染乳腺癌细胞的新型AAV病毒载体，其主要是通过一种新的AAV病毒载体的包装方法实现的，具体步骤如下：
[0005](1)以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过突变VP1蛋白T138位点为A获得表达VP1及VP3的pRVP1/3质粒，衣壳pRVP1/3DNA序列为SEQ ID NO：1；
[0006](2)以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过对pRC质粒的VP2蛋白M1和M203位点进行定点突变，获得质粒pVP2，该质粒提供衣壳蛋白VP2，其DNA序列为SEQ ID NO：2；
[0007](3)将步骤(1)得到的质粒pRVP1/3，步骤(2)得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统；
[0008](4)将步骤(3)得到的包装系统，包装AAV病毒。
[0009]步骤(1)中质粒RVP1/3为PCR模板，将衣壳蛋白VP1第585位点精氨酸突变为丙氨
酸，第588位点的精氨酸突变为丙氨酸，获得pRVP1/3M质粒，衣壳pRVP1/3M质粒DNA序列为SEQ ID NO：3。
[0010]将pRVP1/3M质粒、步骤(2)得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统，并包装成AAV病毒。
[0011]步骤(2)中在pVP2质粒基础上，将EC1蛋白序列插入VP2蛋白氨基端，获得pVP2
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EC1质粒。
[0012]步骤(2)所述的EC1蛋白序列由Nikolas Stefan等人通过噬菌体展示技术筛选得到，DNA序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
[0013]将pRVP1/3M质粒或者pRVP1/3质粒，pVP2
‑
EC1质粒，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统，并包装成AAV病毒。
[0014]步骤(3)所述的质粒pAAV为pAAV
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eGFP，pAAV
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Luciferase、pAAV
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TK表达质粒中的任意一种。
[0015]作为优选方案，以10cm皿为例，本专利技术包装得到的病毒包括如下：
[0016]8μg pVP2、8μg pRVP1/3、10μg pHelper和6μg pAAV
‑
luciferase用于包装AAV2
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LUC病毒，
[0017]8μg pVP2、8μg pRVP1/3、10μg pHelper和6μg pAAV
‑
TK用于包装AAV2
‑
TK病毒，
[0018]8μg pVP2、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV
‑
luciferase用于包装AAV2M
‑
LUC病毒，
[0019]8μg pVP2
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EC1、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV
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luciferase用于包装AAV2M
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EC1
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LUC病毒，
[0020]8μg pVP2
‑
EC1、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV
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TK用于包装AAV2M
‑
EC1
‑
TK病毒。
[0021]对包装后的AAV病毒载体进行离心纯化，然后采用Western Blotting检测AAV病毒衣壳中三种成分：VP1，VP2，VP3的表达情况，从而评估AAV病毒的改造情况。
[0022]本专利技术将所述得到的AAV病毒载体在制备靶向治疗乳腺癌的药物上的应用。
[0023]所述的AAV病毒载体携带自杀基因HSV
‑
TK在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物上的应用。所述的乳腺癌细胞为4T1乳腺癌细胞。
[0024]通过靶向感染小鼠移植瘤实验评估AAV2
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LUC，AAV2M
‑
LUC以及AAV2M
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EC1
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LUC病毒载体在小鼠组织器官中的分布情况，其方法是为通过小鼠尾静脉注射携带luciferase的AAV病毒，小动物活体成像检测AAV病毒在小鼠体内的分布情况；取小鼠的各个脏器进行成像检测AAV病毒的分布情况。
[0025]本专利技术还提供一种基于AAV病毒载体的包装方法获得的AAV2
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EC1病毒的应用，其技术方案为构建pAAV
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TK质粒替换pAAV
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luciferase质粒，然后进行病毒包装，将获得病毒通过静脉注射的方式注射到荷瘤小鼠内，通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过突变VP1蛋白T138位点为A获得表达VP1及VP3的pRVP1/3质粒，衣壳VP1/3 DNA序列为SEQ ID NO：1；（2）以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过对pRC质粒的VP2蛋白M1和M203位点进行定点突变，获得质粒pVP2，该质粒提供衣壳蛋白VP2，其DNA序列为SEQ ID NO：2；（3）将步骤（1）得到的质粒pRVP1/3，步骤（2）得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统；（4）将步骤（3）得到的包装系统，包装AAV病毒。2. 根据权利要求1所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，步骤（1）中质粒RVP1/3为PCR模板，将衣壳蛋白VP1第585位点精氨酸突变为丙氨酸，第588位点的精氨酸突变为丙氨酸，获得pRVP1/3M质粒，衣壳VP1/3M DNA序列为SEQ ID NO：3。3.根据权利要求2所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，将pRVP1/3M质粒、步骤（2）得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统，并包装成AAV病毒。4. 根据权利要求3所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，步骤（2）中在pVP2质粒基础上，将EC1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕亚丰，曹春雨，张浩，黄文峰，黄晓飞，吴红艳，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：